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乙酰辅酶 A 羧化酶(ACC)活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格:50T/24S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1.试剂二:临用前将试剂二 B、试剂二 C 倒入试剂二 A,充分溶解待用;可分装后-20℃保存,避免反复冻融;
2.试剂三:临用前加入 6 mL 双蒸水,充分溶解待用;可分装后-20℃保存,避免反复冻融;
3.试剂四:临用前加入 15 mL 双蒸水,溶解后 4℃保存一周;
4.试剂五:临用前加入 15 mL 双蒸水,溶解后 4℃保存一周;
5.标准品:10 μmol/mL 标准磷贮备液;
6.提取液的配制:按提取液一:提取液二=990:10(V:V)的比例配制,根据样本量现配现用,禁止将提取液二一次性全部加入提取液一混匀分装待用;
7.工作液(定磷剂)的配制:按 H2O:试剂四:试剂五:试剂六=2:1:1:1 的比例配制,配好的工作液应为浅黄色;若变色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染,工作液应现配现用;
注意:配试剂最好用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。
产品说明:
乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)在生物体内催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A,是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。
ACC能够催化乙酰辅酶A、NaHCO3和ATP生成丙二酰辅酶A、ADP和无机磷,钼蓝与磷酸根生成660nm有特征吸收峰的物质,通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来测定ACC活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者
增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、天平、低温离心机、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、漩涡震荡仪、水浴锅、
蒸馏水、冰盒、EP管。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参文献)
1、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后,8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
2、细菌或细胞:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
3、血清(浆):直接测定。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至660nm,蒸馏水调零。
2、 临用前将试剂一、试剂二、试剂三在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10min。
3、 将10μmol/mL标准液用蒸馏水稀释为1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078μmol/mL的标准溶液备用。
4、 操作表:(在1.5mL离心管中依次加入下列试剂)
以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA带入方程得到x(μmol/mL)。
2. 按蛋白浓度计算
酶活定义:每小时每毫克组织蛋白产生1μmol无机磷的量为一个ACC活力单位。
ACC酶活(U/mg prot)=x×V总÷(V样×Cpr)÷T=20x÷Cpr
3. 按样本质量计算
酶活定义:每小时每g组织产生1μmol无机磷的量为一个ACC活力单位。
ACC酶活(U/g 质量)=x×V总÷(V样×W÷V样总)÷T=20x÷W
4. 按照细菌或细胞数量计算
酶活定义:每小时每104个细菌或细胞产生1μmol无机磷的量为一个ACC活力单位。
ACC酶活(U/104 cell)=x×V总÷(V样×细胞数量(万个)÷V样总)÷T=20x÷细胞数量(万个)
5. 按液体体积计算
酶活定义:每小时每mL液体产生1μmol无机磷的量为一个ACC活力单位。
ACC酶活(U/mL)=x×V总÷V样÷T=20x
V总:酶促反应总体积,0.5mL;V样:加入样本体积,0.05mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,0.5h;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g。
注意事项:
1、 工作液(定磷剂)应现配现用,正常颜色为浅黄色,如有变色或变蓝则均为失效。
2、 此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管或 EP 管等试验器材均要求严格无磷。
3、 显色结束后应立即检测。
4、 当 ΔA 大于 1 时,建议将样本用提取液稀释后再进行测定。
5、 由于提取液中含有蛋白(约 1mg/mL),若需要测定样本的蛋白浓度,需要减去提取液本身的蛋白浓度。
实验实例:
1. 取0.1g苦麻菜,加入1mL提取液,进行冰浴匀浆,然后8000g 4℃离心10min,取上清,之后按照测定步骤操作,测得计算ΔA=A测定管-A对照管=0.519-0.092=0.427,标准曲线y=0.7329x+0.0109,则x=0.5677,按样本质量计算酶活得:ACC酶活(U/g 质量)=20x÷W=113.54 U/g 质量。
2. 取 0.1g 肝脏组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆,然后 8000g 4℃离心 10min,之后按照测定步骤操作,测得计算 ΔA=A 测定管-A 对照管=0.445-0.238=0.207,标准曲线 y=0.7329x+0.0109,则 x=0.2676,按样本质量计算酶活得:ACC 酶活(U/g 质量)=20x÷W=53.52 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!