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胞浆异柠檬酸脱氢酶(ICDHc)活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
规格:50T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1.试剂一:用时加入 50 mL 提取液溶解;
2.试剂二:用时每支加 275 μL 双蒸水充分溶解备用;
3.试剂三:用时每支加 275 μL 双蒸水充分溶解备用;
4.工作液配制:将试剂一、试剂二、试剂三按 85:1:1 的比例混合,现用现配。
产品说明:
ICDHc(EC 1.1.1.42)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化异柠檬酸脱氢脱羧生成 α-酮戊二酸,同时还原 NADP+生成 NADPH。ICDHc 是细胞质中除了磷酸戊糖途径外又一种 NADPH 重要来源,在逆境中该酶活性通常会发生显著变化。
利用 ICDHc 催化 NADP+还原成 NADPH 反应,在 340nm 下测定 NADPH 浓度的增加,即可反映 ICDHc 活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌、细胞或组织样本的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每 200 万细菌或细胞加入 400μL 提取
液,超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰
上待测。
组织:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样本:直接检测。
二、测定步骤
1. 紫外分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2. 按下表步骤加样:
将上述试剂按顺序加入 1mL 石英比色皿中,加样本的同时开始计时,在 340nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1;迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃水浴中,准确反应 2 分钟;迅速取出比色皿并擦干,记录 2 分 20秒时的吸光度 A2。计算 ΔA=A2-A1。
三、ICDHc 活力单位的计算
1、血清(浆)ICDHc 活力的计算
单位的定义:每 mL 血清(浆)在反应体系中每分钟生成 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
ICDHc(U/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样本÷T=1608×ΔA
2、组织中 ICDHc 活力的计算
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
ICDHc(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样本×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr
(2)按样本质量计算:
单位的定义:每 g 组织在反应体系中每分钟生成 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
ICDHc(U/g 质量)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V 提取×V 样本)÷T=1608×ΔA÷W
3、细菌或培养细胞中 ICDHc 活力的计算
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
ICDHc(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样本×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr
(2)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成 1nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
ICDHc(U/104 Cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样本×500)÷T=3.2×ΔA
V 反总:反应总体积,0.001L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103L/moL/cm;d:石英比色皿光径,1cm;V样本:加入样本体积,0.05mL;V 提取:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,2min;500:细菌或细胞密度,500 万/mL。
注意事项:
1、若 A2-A1 大于 0.5,需将酶液用提取液稀释,使 A2-A1 小于 0.5,可提高检测灵敏度。若初始值 A1 大于 0.5 可尝试将酶液用提取液稀释。
2、实验时,试剂二、试剂三和样本在冰上放置,以免变性和失活;工作液 37℃水浴放置。
3、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃,取小烧杯一只装入一定量的 37℃蒸馏水,将此烧杯放入 37℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
4、最好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。
实验实例:
1. 取 0.1g 稗草,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆,然后 8000g 4℃离心 10min,取上清,之后按照测定步骤操作,
测得计算 ΔA=A2-A1=0.240-0.224=0.016,按样本质量计算酶活得:
ICDHc(U/g 质量)=1608×ΔA÷W=257.28 U/g 质量。
2. 取 0.1g 小鼠肺部组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆,然后 8000g 4℃离心 10min,取上清稀释 5 倍,之后按照测定步骤操作,测得计算 ΔA=A2-A1=0.253-0.141=0.112,按样本质量计算酶活得:
ICDHc(U/g 质量)=1608×ΔA÷W×5=9004.8 U/g 质量。
3. 取小鼠血清样本直接检测,测得计算 ΔA=A2-A1=0.225-0.2=0.025,按血清计算得:
ICDHc(U/mL)=1608×ΔA=40.2 U/mL。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!