一、实验目的
该方案旨在开发一种基于导电性调节的双极电化学发光(The bipolar electrode based ECL,BPE-ECL)传感平台,用于无指示剂的均相生物分析。该平台通过导电性生物传感技术与ECL报告系统的结合,实现了在无需外源电活性指示剂的情况下进行目标检测。研究以miRNA-21的检测为示范,探索该方案的可行性和应用前景。
二、实验使用的仪器设备和耗材试剂
1. 仪器设备
超微弱发光分析仪:BPCL-2,结合光电倍增管(PMT)操作电压为-800V,用于测量ECL发光强度。
电化学工作站:用于施加电位。
电导率仪:用于测量溶液的电导率。
电泳仪:用于聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),验证核酸杂交链式反应(HCR)。
生物分子成像仪:用于电泳结果成像。
2. 耗材试剂
聚二甲基硅氧烷(PDMS):用于制作传感和报告池。
Ru(bpy)32+和TPrA:作为ECL检测体系的核心试剂。
氯金酸(HAuCl4):用于电极金属化处理。
合成核酸:由Sangon Biotech提供,包括探针DNA、H1、H2及目标miRNA-21等。
人乳腺癌细胞:用于miRNA-21的实际应用检测。
超纯水:18.2 MΩ·cm,作为所有实验的溶剂。
三、实验过程
1. BPE传感器的制作
(1). ITO玻璃板的准备:从供应商处采购电阻小于6Ω/平方的ITO玻璃板,并在其上制作导电BPE,确保传感池包含BPE的阴极和驱动电位的阳极,而报告池包含BPE的阳极和驱动电位的阴极。
(2). 电沉积金:为了提高导电性,分别在BPE的阴极和驱动电位的阴极上进行金电沉积。
2. 杂交链式反应(HCR)的进行
(1). 反应混合:在超纯水中混合探针DNA、H1和H2,浓度分别为0.5 μM、5 μM和5 μM。
(2). 目标miRNA-21的添加:将不同浓度的miRNA-21加入混合物中,37°C孵育2小时以进行HCR反应。
3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)验证:
(1). 电泳条件:在TBE缓冲液(1×)中,恒定电压80V,室温下进行2小时电泳。
(2). 成像分析:使用生物分子成像仪拍摄凝胶,以验证探针DNA、H1和H2的杂交情况。
4. BPE-ECL传感检测
(1). 准备工作溶液:在报告池中加入200μL含有5mM Ru(bpy)32+和5mM TPrA的PBS缓冲液(0.1 M,pH 7.0),在传感池中加入HCR孵育后的样品。
(2). ECL测量:使用循环伏安法,电位范围为1.0-4.5V,扫描速率为100 mV/s,进行ECL测量。每个样品测量三次,计算标准偏差。
四、实验结果与讨论
1. HCR反应和导电性变化的验证
(1). PAGE分析(图1A):短核酸(探针、H1、H2)在低分子量位置显示荧光带,而miRNA-21诱导的核酸聚合物在高分子量位置显示。这验证了目标miRNA-21触发了探针、H1和H2的杂交反应。
(2). 导电性测量(图1B):混合短核酸后溶液的导电性显著增加,而加入miRNA-21后,导电性显著下降。这表明生成的长核酸聚合物导电性较差。
(3). ECL测量(图1C):ECL强度在短核酸(22 bp)溶液中显著高于长核酸(1250 bp),进一步验证了导电性对BPE-ECL系统的重要影响。
(4). ECL响应的验证(图1D):相较于无miRNA-21存在的情况(曲线g),miRNA-21存在时ECL响应显著降低(曲线h),因为miRNA-21诱导的HCR生成了导电性较差的核酸聚合物。
图1. (A) PAGE分析: (a-c通道) 探针、H1、H2;(d通道) H1 + H2;(e通道) 探针 + H1 + H2;(f通道) 探针 + H1 + H2 + miRNA-21。(B) 对应PAGE相同条件下的导电性比较。(C) 5 μM短链(22 bp)和长链(1250 bp)核酸溶液的ECL响应比较。(D) BPE-ECL生物测定在无miRNA-21 (g) 和有1 pM miRNA-21 (h) 情况下的ECL响应。
2. 分析条件的优化
(1). 探针浓度(图2A):ECL强度差值(ΔECL)随着探针浓度的增加而增加,在浓度超过0.5 μM后达到平台期。因此,选用0.5 μM作为最佳探针浓度。
(2). H1/H2浓度(图2B):随着H1/H2浓度的增加,ΔECL响应持续增强,在5 μM时达到饱和,表明5 μM为最佳H1/H2浓度。
(3). 温度(图2C):ΔECL响应随着温度升高至37°C后增加,随后略有下降,表明最佳反应温度为37°C。
(4). 反应时间(图2D):ΔECL响应随HCR反应时间的延长而增加,在120分钟后达到最大,选择120分钟作为最佳反应时间。
图2. (A) 探针浓度,(B) H1/H2浓度([H1]:[H2] = 1:1),(C) 温度,和 (D)反应时间对ΔECL响应的影响。所有实验中的miRNA-21浓度均为1 pM。
3. 传感系统的性能评估
(1). 检测限与线性范围(图3):不同浓度miRNA-21的ECL响应如图3A所示。ECL强度与miRNA-21浓度的对数呈良好线性关系(图3B),线性范围为1 fM至10 nM,检测限为0.33 fM。
图3. (A) 不同浓度miRNA-21的ECL响应: (a−i) 空白, 1 fM, 10 fM, 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 nM, 10 nM。(B) ECL强度与miRNA-21对数浓度之间的线性关系。
(2). 选择性(图4A):高结构类似物(miRNA-122、miRNA-141、miRNA-155)的检测结果表明,BPE-ECL传感系统对miRNA-21具有良好的特异性。
(3). 稳定性和重复性(图4B, 4C):ECL信号在八次重复测量中稳定,RSD为2.56%,三种不同浓度miRNA-21的RSD分别为3.2%、2.4%和1.4%,表明系统具有良好的稳定性和重复性。
(4). 实际应用(图4D):检测不同数量MCF-7细胞裂解液中的miRNA-21,ECL信号随细胞数量增加而下降,验证了该传感平台在临床样品检测中的应用潜力。
图4. (A) 不同miRNA类似物的ECL响应,miRNA-122、miRNA-141和miRNA-155浓度为10 pM,miRNA-21浓度为1 pM。 (B) BPE-ECL生物传感平台的稳定性。 (C) BPE-ECL传感器对不同浓度miRNA-21响应的重现性。 (D) 不同数量MCF-7细胞裂解液的ECL响应。
五、结论
本方案提出了一种基于导电性调节的BPE-ECL生物传感平台,该平台利用目标miRNA-21诱导的HCR反应生成长链核酸聚合物,导致传感池导电性降低,进而减少报告池的ECL信号输出。该平台具备传统BPE-ECL传感器的优点,通过物理分离传感和报告反应有效避免了干扰,且无需外源电活性指示剂。该方案简单、灵敏、快速,并在实际样品检测中表现出良好的应用前景。未来,该方案有望进一步应用于包括DNA、小分子、蛋白质、细胞和细菌等多种目标的定量和定性检测。
*因学识有限,难免有所疏漏和谬误,恳请批评指正*
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