硝酸盐蛋白胨水培养基的实验原理与方法及应用！

                  硝酸盐蛋白胨水培养基的实验原理与方法及应用！

一、背景

硝酸盐蛋白胨水培养基是一种常用的培养基，用于硝酸盐还原产气试验。硝酸盐蛋白胨水培养基的配方包括蛋白胨、酵母浸粉、硝酸钾和亚硝酸钠等物质，硝酸盐蛋白胨水培养基可以用于鉴别绿脓杆菌分解硝酸盐产气试验。

硝酸盐还原产气试验是一种常用的鉴定细菌的方法。它是根据某些细菌能还原硝酸盐为亚硝酸盐，亚硝酸盐与醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的对氨基苯磺酸作用生成重氮基苯磺酸，后者与α-萘酚反应生成红色的N-α-苯胺偶氮苯磺酸。若试验菌可利用硝酸盐产亚硝酸盐进一步转化为氮气，则小倒管中会有气体囤积，判定为阳性。

二、硝酸盐还原产气试验方法及原理

方法：取可疑菌落接种在含小导管的硝酸盐蛋白胨水培养基内，35℃培养24小时，小导管内有气体产生实验结果为阳性，否则为阴性。

原理：硝酸盐胨水培养基主要用于硝酸盐还原实验。蛋白胨、酵母粉提供碳氮源、维生素和生长因子；硝酸钾为可利用的硝酸盐。铜绿假单胞菌是一类专性需氧菌、以有机碳作为能源的异养硝化菌，能通过产生的酶分四步还原硝酸盐，将硝酸盐分解产生氮气。

用法：称取本品15.5g,加热溶解于1000ml蒸馏水中,分装试管,并加入小倒管,115℃高压灭菌20分钟,备用。

三、应用

硝酸盐蛋白胨水培养基可以用于植物乳杆菌SG-5的安全性评价及对SD大鼠肠道微生物的影响：

从桑叶中分离到一株高产γ-氨基丁酸植物乳杆菌(γ-aminobutyric acid,GABA),命名为SG-5,该菌株GABA产量为7.24g/L,具有显著抑制血管紧张素转移酶能力。

为了明确其对动物的安全性,本研究首先分析菌株SG-5的生物特性,然后从动物毒理学实验、有害代谢产物、菌株耐药性三个方面来评价SG-5的安全性,最后应用高通量测序技术分析其对大鼠肠道微生物的影响,为其开发应用提供理论依据,研究结果如下:

1、菌株SG-5的生物特性分析。对SG-5的耐胆盐能力、耐酸碱稳定性和耐热性进行研究,结果证明菌株在0.8%胆盐浓度下的耐受力为39.19%,低于0.8%胆盐浓度下均能存活,具有较强的耐胆盐能力;SG-5在Na Cl质量浓度低于8%的条件下均能存活,在8.0%Na Cl浓度的耐受力为17.73%;在酸性条件下p H>3.0时SG-5生长良好,碱性条件下p H<8.0之间时生长较为良好;用50℃的温度水浴处理菌株半小时后,于37℃恒温培养,菌株生长良好。

2、毒理学试验。首先进行急性经口毒性试验,对SD大鼠连续以8×1012CFU/kg的剂量灌胃SG-5菌液14天,SD大鼠没有异常现象的发生,得到半数致死量LD50远远大于6000mg/kg。然后对SD大鼠进行28天经口毒性试验,将四周龄SD大鼠分为四组,根据大鼠体重按8×1012CFU/kg、8×1010CFU/kg、8×108CFU/kg、0CFU/kg的剂量连续灌胃28天,观察喂养过程中有无中毒反应。第29天对SD大鼠进行麻醉解剖并采血,同时观察有无脏器病变,对心、肝等脏器进行指数分析,WBC、RBC等8项血液常规进行检查,K、Na等21项血液生化指标进行检测,同时进行尿常规检查。结果表明各项指标在正常范围内,且与对照组相比无显著差异(P>0.05)。未得到最小观察有害作用剂量(LOAEL)和未观察到有害作用剂量(NOAEL),说明SG-5的NOAEL>8×1012CFU/kg。对大鼠脏器进行细菌易位检查,没有易位现象生物发生。实验结果初步表明SG-5为安全性菌株。

3、菌株SG-5有害代谢产物评价试验。细菌在生长过程中会出现某些有害代谢产物,用血平板对菌株SG-5进行溶血实验,没有溶血现象;用氨基脱羧酶培养基培养SG-5菌株,检测SG-5是否产生氨基脱羧酶,结果为阴性,说明SG-5不产生氨基脱羧酶;用蛋白胨水培养基培养菌株检验是否具有分解色氨酸的能力,试验结果为阴性;同时用硝酸还原酶试剂盒检测菌液中是否含有硝基还原酶,结果表明不产生硝基还原酶。

4、菌株SG-5耐药性分析。使用KB药敏纸片琼脂扩散法检测SG-5对哌拉西林等12种抗生素是否具有抗性,并提取SG-5的质粒,检测是否含有耐药性基因,实验结果显示SG-5对哌拉西林、阿莫西林、四环素、氯霉素、罗红霉素、青霉素等6种抗生素敏感;对利福平、红霉素中度敏感;对庆大霉素、卡那霉素、链霉素、环丙沙星等7种抗生素耐药,菌株不含有耐药性质粒。

5、菌株SG-5对肠道微生物的影响。SD大鼠28天喂养实验结束时,收集大鼠的盲肠粪便,采用宏基因组学研究方法,利用高通量测序技术测定肠道的微生物菌落组成,进行OUT及丰度等分析。

结果表明中剂量灌胃组(8×1010CFU/kg)盲肠微生物物种丰度、多样性及乳酸菌含量大大增加,有害菌群减少。综上所述,菌株SG-5为一株安全性菌株,适宜的剂量范围能够提高盲肠微生物的丰度及多样性。

北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！