小鼠肺成纤维细胞的知识与应用及培养操作步骤！

                   小鼠肺成纤维细胞的知识与应用及培养操作步骤！

一、背景

小鼠肺成纤维细胞是肺间质中数量最多的细胞类型之一。这些细胞与普通的成纤维细胞相似，但具有一些独特的特征，例如它们有很长的分枝过程及间隙连接。

小鼠肺成纤维细胞主要来源于肺组织，肺是机体的呼吸器官，位于胸腔，左右各一，覆盖于心之上。肺有分叶，左二右三，共五叶。肺经肺系（指气管、支气管等）与喉、鼻相连，故称喉为肺之门户，鼻为肺之外窍。

成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。它们较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。这些细胞功能活动旺盛，细胞质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动。在一定条件下，成纤维细胞可以实现跟纤维细胞的互相转化。

小鼠肺成纤维细胞的主要功能为分泌肺泡隔基质中的III型胶原、弹性蛋白以及蛋白多糖，也在肺部受损时担任重要的修复和重建功能。肺部受伤后，在炎症部位的一定程度的成纤维细胞积聚是肺部复原的关键步骤，过多或者不足的成纤维细胞聚集都会导致肺功能异常。

小鼠肺成纤维细胞是一种在肺组织中发挥重要作用的细胞类型。它们属于肺泡间质细胞，主要负责产生和维护肺泡的结构完整性，参与肺组织的修复和再生过程。

在正常情况下，肺成纤维细胞处于静息状态，不参与免疫反应。然而，在某些病理条件下(如肺部感染、炎症、损伤或纤维化)，肺成纤维细胞会被激活并增殖，产生大量的胶原蛋白和其他细胞外基质组分，导致肺组织的纤维化和功能受损。

二、小鼠肺成纤维细胞培养操作

1)复苏小鼠肺成纤维细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)小鼠肺成纤维细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)小鼠肺成纤维细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

小鼠肺成纤维细胞可以用于麦味养肺汤通过p53抑制肺成纤维细胞衰老抗肺纤维化的机制研究：

MWYF在体内和体外抑制肺成纤维细胞衰老的研究：

①体内:通过衰老相关β-半乳糖苷酶(Senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-Gal)染色观察小鼠肺组织衰老情况,利用Western Blot检测衰老相关蛋白p53、p21和p16在小鼠肺组织中的表达情况,通过免疫荧光观察肺组织中成纤维细胞标志物α-SMA与衰老相关蛋白p53、p21和p16的共染情况。

②体外:提取小鼠肺成纤维细胞,利用免疫组化对提取的成纤维细胞进行鉴定,通过CCK-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)确定MWYF冻干粉给药剂量。将原代肺成纤维细胞分为空白组,模型组,MWYF低剂量组(400μg/mL),MWYF中剂量组(600μg/mL)和MWYF高剂量组(800μg/mL)。利用阿霉素(Doxorubicin,DOX)干预48 h建立细胞衰老模型,分别用含不同浓度MWYF冻干粉的培养基干预24h,通过SA-β-Gal染色观察肺成纤维细胞衰老情况,利用Western Blot检测衰老相关蛋白p53、p21、p16和衰老相关分泌因子(Senescence-associated secretory phenotype,SASP)在小鼠肺成纤维细胞中的表达情况。

MWYF在体内和体外抑制肺成纤维细胞衰老的研究:在小鼠体内,发现MWYF能够降低肺组织中SA-β-Gal活性,减少衰老相关蛋白p53、p21和p16的表达水平,同时通过双荧光标记发现MWYF可以减少小鼠肺成纤维细胞衰老。在体外,发现MWYF能够降低肺成纤维细胞中SA-β-Gal活性,减少衰老相关蛋白p53、p21和p16的表达水平,抑制SASP表达。体内和体外结果均显示MWYF高剂量组冻干粉效果最为明显。

MWYF通过p53抑制肺成纤维细胞衰老的研究:通过质粒载体对肺成纤维细胞实现p53基因沉默后发现,MWYF减少小鼠肺成纤维细胞衰老作用受到抑制,降低p21和p16蛋白表达能力受到抑制;通过质粒载体对肺成纤维细胞实现p53基因过表达后发现,MWYF减少肺成纤维细胞衰老作用未受抑制,降低p21和p16蛋白表达能力也未受到抑制。

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