RSV疫苗纯化方案分享

人呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）是一种非节段性单股复链RNA病毒，属于副黏病毒科，肺病毒属，肺病毒亚科，分A、B两个亚型，呈季节性流行：A、B亚型交替或共循环。

RSV的基因组全长为15.2Kb，编码11个病毒蛋白，其中病毒包膜上有三种蛋白：粘附蛋白G，融合蛋白F和小疏水蛋白SH。G和F蛋白在病毒感染过程中起核心作用，因此在RSV疫苗开发中，主要针对G蛋白和F蛋白开展抗原设计。

目前国内外RSV疫苗按照研发技术路线可分为：重组减毒活病毒（LAVs）疫苗、重组亚单位疫苗、mRNA疫苗、腺病毒载体疫苗。

RSV重组减毒活病毒疫苗

与其他类型的疫苗相比，在不强制添加佐剂的情况下，重组减毒活疫苗（LAVs）诱导的免疫应答与病原体自然感染时的应答相似，从而诱导更高的免疫应答。代表性的产品有Blue Lake Biotechnology的BLB-201，Codagenix公司的CodaVax-RSV，Sanofi Pasteur的VAD00001等。

此类疫苗生产需要获得减毒活病毒，可采用的工艺如下：

将收获的病毒液经过核酸酶处理和过滤澄清后，利用Diamond Layer 700填料进行纯化，以高效去除宿主蛋白和核酸。此工艺具有高上样量（可达10 CV）和高回收率（50%~60%）的优点，确保病毒的纯度和活性。

Fig. 1 RSV重组减毒活病毒获取工艺流程

RSV重组亚单位疫苗

研发机构通常选择RSV的G或F表面蛋白进行抗原分子设计，此类疫苗由于缺乏整个病原体的基因组，具有更高的疫苗安全性水平，适用于免疫功能低下的人群或老年人。采用G蛋白的代表如艾棣维欣，采用F蛋白的代表为GSK的Arexvy和辉瑞的双价RSV疫苗Abrysvo。

以制备F蛋白为例，可采用以下工艺过程：

经CHO细胞培养，收获上清并澄清，第一步层析为亲和填料Diamond Viru-S对RSV Pre F蛋白捕获和提纯，宿主蛋白流穿。

第二步使用高分辨阴离子交换填料Diamond Q Mustang层析，采用结合洗脱模式进一步去HCP和HCD等杂质。

第三步层析可使用复合模式填料Diamond MIX-A结合模式，实现产品相关杂质和痕量宿主蛋白的去除。

随后进行纳滤、超滤和除菌过滤获得抗原原液。

Fig. 2 抗原原液获取工艺流程

RSV mRNA疫苗

mRNA作为疫苗平台只携带特定蛋白的遗传信息，由于宿主遗传物质受到干扰和修饰的可能性较低，因此具有较高的安全性。代表性产品如Moderna的mRNA-1325。mRNA类疫苗工艺包括了质粒模板的制备、mRNA的合成与纯化、LNP的制备及无菌灌装等步骤。

质粒的制备工艺可以选择经典的三步法工艺：

Fig. 3 质粒纯化三步法工艺流程

使用限制性内切酶获得的线性化质粒DNA，可使用Q Bestarose HP去除较大的宿主基因组DNA、质粒DNA及部分酶。体外转录后的mRNA形式RSV疫苗纯化，捕获层析可选用复合模式填料Diamond Layer 700，流穿模式有效去除消化后的pDNA、酶及NTP等工艺相关杂质。精细纯化可以选择高分辨率强阴离子交换填料如Diamond Q Mustang或BestPoly 30Q，也可以选择高分辨率疏水填料Diamond Phenyl Mustang或Diamond Butyl Mustang，去除片段或dsRNA等产品相关杂质。

Fig. 4 mRNA形式RSV疫苗纯化工艺流程

RSV病毒载体疫苗

用于RSV疫苗的病毒载体类型主要有腺病毒载体和痘病毒载体。已批准上市的腺病毒载体新冠疫苗具有较为成熟的生产工艺。RSV病毒载体疫苗代表性研发厂家为Janssen和Bavarian Nordic。

以腺病毒载体为例，可采用以下工艺：HEK293细胞培养和病毒感染，感染结束后可以用表面活性剂对细胞进行裂解，核酸酶进行宿主核酸的降解，裂解液经深层滤器进行澄清，再经300 kDa的中空纤维进行浓缩及换液，而后经过Diamond Q Mustang初步纯化及Diamond Layer 700精细纯化，层析后料液通过300 kDa超滤浓缩换液得到最终的疫苗原液。

Fig. 5 疫苗原液获取工艺流程

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