NRK（大鼠肾细胞）的特点与培养及应用！

                      NRK（大鼠肾细胞）的特点与培养及应用！

一、背景

NRK（大鼠肾细胞）是一种来源于正常大鼠肾脏的细胞系，常用于研究肾脏生物学、药物筛选、毒性测试以及病毒学研究。

二、NRK细胞系具有以下特点

来源：NRK细胞系是从正常大鼠肾脏组织中建立的，通过多次传代培养而形成稳定的细胞系。

形态特征：NRK细胞通常呈现成纤维细胞样的形态，呈梭形或多角形，细胞大小和形态可能会根据培养条件和细胞密度而有所变化。

生长特性：NRK细胞在适宜的培养条件下（如含有适量胎牛血清的DMEM培养基）可以稳定生长，具有较快的增殖速率。

应用：由于NRK细胞来源于正常的肾脏组织，它们常用于研究肾脏细胞的生理和病理过程，以及作为体外模型来评估药物的肾脏毒性。此外，NRK细胞也被用于研究病毒感染，尤其是那些能够感染肾脏细胞的病毒。

变异株：NRK细胞系有几个亚型，如NRK-49F和NRK-52E，这些亚型可能具有不同的特性和应用领域。

优势：NRK细胞系的优势在于它们相对容易培养，生长迅速，且能够代表正常肾脏细胞的特性，这使得它们成为研究肾脏相关疾病的理想模型。

三、NRK细胞系培养操作

1)复苏NRK细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)NRK细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)NRK细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

四、应用

NRK（大鼠肾细胞）可以用于肿瘤相关成纤维细胞NRK促进肺腺癌迁移侵袭作用及机制研究：

肿瘤相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblasts,CAFs)是肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)中的主要成分。靶向CAFs治疗已成为肿瘤治疗中一种有前景的治疗方式。通过转录组学测序、综合生物信息学分析以及细胞、临床标本检测,我们发现CAFs高表达NRK(Nik-related kinase),并且我们进一步探究CAFs高表达NRK对肺腺癌细胞迁移侵袭的作用及相关机制,为靶向CAFs治疗提供新的潜在靶点。

方法：

1、收集肺腺癌新鲜手术标本,采用组织块贴壁培养法,分离CAFs、正常肺成纤维细胞(Normal Fibroblasts,NFs)。光学显微镜观察CAFs、NFs形态、蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)和免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测成纤维细胞标记物的表达,鉴定成纤维细胞。

2、收集培养CAFs、NFs细胞72小时后的无血清DMEM培养基,离心后取上清,得到CAF条件培养基(Cancer associated fibroblasts conditional medium,CAF-CM)和NFs条件培养基(Normal fibroblasts conditional medium,NF-CM)。检测CAF-CM、NF-CM对肺腺癌细胞(A549和H1299)增殖、侵袭、迁移的影响。

3、根据我们本次CAFs测序数据集,结合课题组前期CAFs基因芯片数据集,以及Array Express公共数据库肺腺癌CAFs差异基因数据集,通过韦恩图,寻找这三个数据集差异倍数(Fold Change,FC)的绝对值大于2,校正P值小于0.05的共有差异基因。最终得到10个交集差异基因(ZNF93、ZNF827、NRK、DPYSL4、HES4、LYPD6B、SETBP1、HMCN1、FCGBP、CFI)。q RT-PCR检测上述10个交集差异基因在CAFs的相对表达水平。q RT-PCR、WB、IF检测CAFs中NRK的表达水平。

4、采用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)法,检测NRK在肺腺癌组织、癌旁组织的表达,分析NRK在肺腺癌的表达水平和临床病理因素的关系。

5、构建NRK干扰慢病毒载体和过表达质粒,在CAFs、NFs分别干扰、过表达NRK基因,q RT-PCR、WB检测干扰或过表达NRK的效果。6.收集干扰或过表达NRK的CAFs条件培养基(CAF-sh NRK-CM)、NFs条件培养基(NF-OE-CM)。检测CAF-sh NRK-CM、NF-OE-CM对A549、H1299细胞的迁移、侵袭的影响,ELISA检测条件培养基中CXCL5的变化。

6、划痕法、Transwell法、WB、IF检测干扰过或表达NRK对CAFs、NFs运动能力的影响、磷酸化Cofilin(p-Cofilin)蛋白表达水平的影响、F-actin的变化。

7、共培养实验观察干扰NRK对CAFs引导A549、H1299运动的影响。

结果：

1、光镜下可见,NFs、CAFs形态相似,呈纺锤形,CAFs细胞体积较NFs更大。WB和IF结果显示,NFs、CAFs均高表达细胞间质标志物波形蛋白(Vimentin),不表达上皮标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)。同时成纤维细胞标志物α-SMA、FAP-α的表达在CAFs高于NFs,差异具有统计学意义(P<0.05)。

2、与NF-CM相比,CAF-CM能够促进肺腺癌细胞(A549和H1299)增殖、迁移、侵袭,差异具有统计学意义(P<0.05)。

3、通过转录组学测序、综合生物信息学分析和q RT-PCR检测,我们发现NRK是10个交集差异基因中,在CAFs表达显著升高的上调差异基因,q RT-PCR、WB、IF结果显示,NRK主要在CAFs高表达(P<0.05),IF结果提示,NRK主要定位在CAFs的细胞质和细胞核。

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