从Q30到Q40——高通量测序技术正在发生变革吗？

基因测序仪是解码生命科学的利器，因其技术壁垒高、开发难度大，市场长期被少数几家跨国企业垄断。近些年，基因测序仪市场格局正在快速发生变化，涌现出许多新企业并纷纷推出自主研发的商品化测序仪。

基于此，仪器信息网特别策划“基因测序仪新势力”(点击查看约稿详情）专题，并向测序技术研究专家、测序仪应用专家和基因测序仪企业广泛约稿（投稿邮箱：lizk@instrument.com.cn），充分了解基因测序新企业、新仪器、新技术及新应用进展。本文将介绍测序仪新星企业Element Biosciences的Avidity（亲和力）测序技术。

新一代测序，英文原文为Next Generation Sequencing，也常被简称为NGS测序，从技术的角度，通常是指一类通过将模版片段化之后进行扩增，然后进行大规模并行测序的技术。与其他测序技术相比，它可以显著提高测序通量，并大幅降低测序成本，所以也通常被称作高通量测序技术。

NGS技术沿革

自2005年454公司推出第一个商业化的高通量测序平台以来，高通量测序技术经历了长足的发展，应用范围也越来越广泛。454公司的测序平台基于焦磷酸（Pyrosequencing）测序技术，于2005年开始商业化发布，后该公司被罗氏（Roche）公司收购，但后续由于测序成本居高不下、操作复杂及精度的问题，目前已经停产。

继罗氏454之后，Solexa公司也于2006年推出了基于边合成边测序（sequence by synthesis, SBS）的测序仪Genome Analyzer，后被美国Illumina公司收购。基于SBS原理的Illumina测序仪是目前全球市场占有率最高的测序平台。

与Solexa同期的还有Applied Biosystems从Agencourt公司收购的基于SOLiD技术（Sequence By Oligo Ligation and Detection）的测序仪，后基于SOLiD技术的测序仪也因操作过于复杂，以及性能和价格缺乏竞争力而最终停产。

Applied Biosystems被Invitrogen公司收购后组成的Life Technologies。2010年，Life Technologies又通过收购Ion Torrent继续在测序市场占有一席之地。2013年，ThermoFisher赛默飞收购Life Technologies。Ion Torrent测序平台的原理类似于焦磷酸测序，但它检测的不是焦磷酸，而是反应同时释放的氢离子。与罗氏454类似，Ion Torrent存在操作复杂、重复碱基读取精度受限、通量提升困难、测序成本过高的问题，虽然依托于赛默飞的支持与销售网络仍旧在测序市场占有一席之地，但由于技术限制，已经远非主流平台，有逐步淡出二代测序市场的趋势。

目前，国内市场还有众多国产NGS平台先后面市，绝大部分均基于SBS的测序原理。

Avidity（亲和力）测序技术引人注目

随着技术的发展以及测序应用边界的不断拓展，近1-2年来也涌现出了更多新的测序技术，其中最引人注目的是Element Biosciences的Avidity（亲和力）测序技术。与SBS不同，亲和力测序的关键创新在于，它将检测掺入的核苷酸与延伸DNA模板分离开来。分离步骤可使每个过程独立优化，使得基于亲和力测序技术的Element AVITI系统成为成本更低、精度更高的DNA测序系统。多年以来，大家使用的测序仪基本的数据质量停留在Q30的标准，即碱基解读的准确性为99.9%，而亲和力测序可将测序质量提升到Q40（99.99%）标准，错误率降低近10倍！这无疑为测序行业带来了新的可能，有望重新塑造行业精度的标准。

简单介绍下它的工作原理：

PCR-Free的Polony生成

亲和力测序可以兼容目前市场上的大部分建库试剂盒，可直接用线性文库加载到流动槽上，在流动槽表面捕获它们之后，仪器将自动将线性文库环化，然后模板的克隆拷贝通过环状循环扩增（RCA）来生成polonies，其中模板的多个拷贝存在于单个DNA多联体模版中。仅从原始模板复制还具有额外的好处，可以消除DNA测序中的一个重要错误来源——PCR。

两份工作，两个步骤

任何基于聚合酶的DNA测序方法都必须完成两项工作：

• 检测核苷酸结合事件

• 将DNA模版延伸到下一个位置

SBS测序将这两个步骤锁定在一起。当一个染料标记的、带有阻断基团的核苷酸被添加到生长中的互补链中时，也同时完成了延伸步骤。共价结合为成像步骤产生持久的信号，但需要微摩尔试剂浓度来驱动反应在合理的时间范围内完成。

通过亲和力测序，Element科学家发明了一种方法，通过分离这两个步骤，仅使用纳摩尔试剂浓度就可以创建稳定的复合物进行成像。

亲和子(Avidites)：低试剂成本和高数据准确性的关键

亲和力是指多个非共价结合相互作用的相加强度，当多价配体与底物内的多个位点结合时，可以实现这种强度。亲和子分子重新构想了核苷酸是如何传递到聚合酶复合物中的，并利用了这一特性。它们是带有多个相同核苷酸的染料标记聚合物。

在DNA聚合酶的存在下，亲和子分子在每个polony内与模板的多个拷贝形成高度稳定的复合物。亲和子分子与DNA聚合酶复合物的结合率与染料标记的单价核苷酸的结合率相似，但与单价核苷酸不同，即使在纳摩尔浓度下，在足够成像所需的>1分钟时间尺度上也没有观察到解离。成像后，亲和子被移去，然后使用工程聚合酶和带有阻断基团、未标记的核苷酸延伸模版。图1显示了完整的亲和力测序周期。

图1：Avidity（亲和力）测序

除了能够降低试剂浓度（从而降低运行成本）外，亲和力测序比SBS更准确，在均聚物区域尤其具有优势（图2）。较高的准确性可能是几个因素的结果：

• 使用工程高保真聚合酶

• 多个核苷酸在单个亲和子上的协同结合，以确保只有正确的同源亲和子与polony结合

• Polony内的非同期延伸的DNA拷贝由于缺乏其他非同期延伸的邻体作为亲合力底物，从而在结合上处于劣势

图2：AVITI和NovaSeq在长度为12或更高的同源聚合物之前和之后读取的错配百分比。

详细阐述亲和力测序原理和性能的文章发表在《Nature Biotechnology》上，可以参考原文，了解具体细节： https://www.nature.com/articles/s41587-023-01750-7

一项具有待开发潜力的新技术

不同于已经发展了20多年且逐渐达到技术边界的SBS技术，亲和力测序是一项新技术，亲和子的模块化设计创造了多个独立的改进空间，使得这项技术具有更加广阔的潜力。聚合物核心、染料的数量和选择以及核苷酸连接体的长度和结构都可以并行优化，以增强信号、减少循环时间、降低试剂浓度，或调整测序反应的其他参数，以更好地适应不同的应用。根据其目前数据结果，相对SBS技术，它已经可以带来以下技术层面的提升：

• 数据精度更高，可将数据质量从SBS测序的Q30（99.9%准确性）提升至Q40（99.99%），从而减少后续false candidates验证的压力

• 显著降低SBS过程中PCR步骤所引入的duplication的比例，有效提升有效数据量，减少浪费

• 大幅提升的2x300 bp读长的测序精度

• 对于低diversity文库，比如甲基化测序，可以不添加平衡文库或仅需很少量的平衡文库即可进行测序

• 兼具低成本和灵活通量两个特性，有多种可选flowcell以适应不同应用，无需凑样即可轻松开机，同时享受和外送工厂级测序服务接近的价格

• 可兼容long-insert文库，从而提升变异recall比率

• 对于基因组困难区域进行测序的能力，比如极大提升了重复连续碱基区域测序的精度，克服了SBS存在的问题

Google AI DeepVariant的Andrew Carroll及其团队近期分享了使用Element Biosciences最新CloudBreak化学试剂的数据分析结果。具体信息可以参考原文：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.08.11.553043v1

Element AVITI测序仪的出现，不仅将测序质量带到了Q40的新标准，同时还解决了以往测序工作中存在的众多困难。同时，它可以台式平台的仪器，提供可以和高通量测序仪接近的测序成本，更是解决了目前困扰众多研究者的台式测序仪测序成本高昂的问题。测序性能的全面提升，由测序原理决定的试剂量节省而带来的测序成本的降低，这些都使得Element Biosciences成为有望颠覆目前测试市场格局的新品牌。

今年9月，自AVITI推出后一年左右的时间，Element Biosciences宣布全球已经获得了超过100台订单，相信后续会看到越来越多提升测序性能为研究所带来的改变和新可能。