中山大学药学院教授,博士生导师。主要从事生物质谱新技术的开发及应用。
大家好,本周为大家分享一篇发表在J. Proteome Res上的文章:Defining the Sarcomeric Proteoform Landscape in Ischemic Cardiomyopathy by Top-Down Proteomics[1],文章的通讯作者是威斯康星大学麦迪逊分校的葛瑛教授。
缺血性心肌病(Ischemic cardiomyopathy,ICM)是一种高度异质性的心血管疾病,大多数是由于左心室收缩功能障碍使得流向心脏的血液减少,从而导致氧气剥夺和心肌缺氧。ICM是心力衰竭的主要病因,是造成全球死亡率升高和疾病负担增加的主要因素之一,但其潜在的分子机制还有待深入研究。肌节作为心脏收缩的基本单位,由以肌动蛋白为基础的细肌丝和以肌球蛋白为基础的粗肌丝组成,它们附着在一个Z盘结构上。研究发现肌节蛋白质翻译后修饰(PTMs)和亚型的改变在心脏生理病理进程中扮演着重要角色。基于质谱的Top-down蛋白质组技术是以完整蛋白质为分析对象,可以提供不同表型心脏病蛋白质PTMs和亚型变化等生物信息,但目前还缺乏ICM肌节proteoforms图谱变化的相关报道。因此,作者利用Top-down蛋白质组学技术,在正常和ICM条件下构建了肌节proteoform图谱,并探究其变化对ICM发病机制的影响,从而为人类ICM的研究提供独到的见解。为了揭示ICM的分子变化情况,作者首先利用不同的pH条件,去除心脏功能正常的供体左心室(Left ventricular,LV)心肌组织(donor,n=16)和ICM患者LV心尖组织(ICM,n=16)的胞质蛋白质,对富集到的肌节蛋白质进行LC-MS/MS检测分析(图1)。心尖是在ICM患者进行左心室辅助装置植入手术期间获取的,实验已经证明LV和心尖组织具有相似的肌节proteoform图谱,两者可以进行相互比较。通过去卷积图谱上proteoform的峰强度与同一蛋白质所有proteoforms的总强度之比来进行蛋白质修饰水平的定量,而蛋白质表达的定量则依赖提取离子色谱图(EIC)峰下面积(AUC)的积分来计算。整个实验流程,从样品制备到LC-MS/MS分析,用时不到3h,表明该方法具有快速与高通量的优点。
图1. 非标记Top-down蛋白质组学的实验流程:对无心脏病史的非衰竭供体(donor,n=16)和ICM患者(ICM,n=16)的LV组织进行肌节蛋白质的提取,然后进行LC-MS/MS分析。Top-down蛋白质组学策略提供了正常供体和ICM心脏组织中的proteoform图谱,如图2所示。作者检测到了许多肌丝蛋白,包括心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)、肌钙蛋白C(troponin C,TnC)、原肌球蛋白(tropomyosin,Tpm)亚型、α-肌动蛋白(α-肌动蛋白)亚型、心室型肌球蛋白轻链2(MLC-2v)、心室型肌球蛋白轻链1(MLC-1v)和心房型肌球蛋白轻链1(MLC-1a),同时也检测到了多种Z盘蛋白,包括ENH2、肌肉LIM蛋白(muscle LIM protein,MLP)、富含半胱氨酸蛋白2(cysteine rich protein 2,CRIP2)、cypher-5、cypher-6、elfin、calsarcin-1(Ca1-1)和四个半LIM结构域蛋白2(four and a half LIM domains 2,FHL2)(图2)。随后,作者采用碰撞活化解离(CAD)模式对所有检测到的肌节蛋白质进行MS/MS分析,以进一步表征蛋白质。比如,实验结果显示MLC-2v上的磷酸化位点位于Ser19,并且实现了21%的序列覆盖率,这些数据表明Top-down的MS/MS分析可以对完整肌丝蛋白质进行测序,以用于蛋白质的鉴定和表征。
图2. 正常供体和ICM患者心脏组织中的proteoform图谱。(a)代表性的基峰色谱图(BPC)表明肌节蛋白和Z盘蛋白呈高分辨分离(MLP、CRIP2、cTnT、ENH2、cypher-6、elfin、cypher-5、FHL2、calsarcin-1、cTnI、Tpm、MLC-1V、MLC-1a、MLC-2v、α-actin和TnC);(b)去卷积质谱图显示肌节蛋白和Z盘蛋白的多样性,红色p和pp分别表示单磷酸化和双磷酸化形式的proteoform。
紧接着,作者对3个正常供体组织样本进行了LC-MS/MS检测,结果表明它们的BPC和总离子色谱图(TIC),以及质谱信号强度的重现性非常好,证明了该分析方法稳健的重现性。为了比较两组样本间的蛋白质表达水平,作者对来自同一正常供体的组织样本,分别提取50、400、500、600、750、1000和1200 ng的总蛋白质进行LC-MS/MS检测以评估仪器响应线性,结果如图3a所示,它们表现出高度相似的proteoform图谱。图3b展示了代表性肌节蛋白(ENH2、cTnI、α-Tpm、MLC-1v、MLC-2v和TnC)的EIC,通过测定每个EIC的AUC丰度总和,建立了250~1200 ng的相互线性范围。如图3c所示,不同总蛋白量相关性结果的R2均大于0.99,表明该检测方法具有优异的重现性、灵敏度和线性,所以有信心将其用于样本间的蛋白质定量。
图3. 关键肌节蛋白相互线性范围响应的测定。(a)50、400、500、600、750、1000和1200 ng总蛋白质的BPC,proteoform图谱高度相似;(b)ENH2、cTnI、α-Tpm、MLC-1v、MLC-2v和TnC的EIC(结合同一蛋白质所有proteoforms前3~5个最丰富电荷状态的离子);(c)每个肌节蛋白的AUC与250~1200 ng总蛋白(每个点重复3次)显示出相互线性相关(R2>0.99)。与正常供体样本相比,作者在ICM组中检测到了cTnI和ENH2的PTM和表达水平的显著变化。在供体和ICM组中,作者检测到了三种主要的cTnI proteoforms,包括未磷酸化的cTnI、单磷酸化的cTnI(pcTnI)和双磷酸化的cTnI(ppcTnI)同样也在两组中检测到了未磷酸化的ENH2和单磷酸化的ENH2(pENH2)(图4a)。与供体组相比,实验观察到ICM组LV组织中cTnI和ENH2表达水平的显著降低(图4b),同时发现它们的总磷酸化水平在ICM组中也显著降低(图4c),其中cTnI和ENH2的总磷酸化水平分别降低了35%和34%。此外,为了确定ICM组织中cTnI和ENH2磷酸化水平的降低是否相互依赖,作者对两者磷酸化水平进行了线性拟合,发现cTnI和ENH2磷酸化水平表现出很强的线性相关(r=0.8926,p<0.00001)(图4d)。这些发现也与作者先前对肥厚型心肌病(Hypertrophic cardiomyopathy,HCM)患者心脏的研究结果相一致(Ying Ge, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2020;117(40):24691-24700),表明可能是由异常的PKA信号通路介导了cTnI和ENH2磷酸化水平的协同降低。
图4. ICM组中cTnI和ENH2磷酸化水平协同降低。(a)正常供体(蓝色)和ICM(红色)中代表性去卷积质谱图和EIC,红色p和pp分别表示单磷酸化和双磷酸化;(b)cTnI和ENH2表达水平的定量,两组在p<0.05时被认为有统计学差异;(c)用mol pi/mol protein计算cTnI和ENH2总磷酸化,水平线代表组内中间值,两组在p<0.001时被认为有统计学差异;(d)cTnI和ENH2磷酸化水平间的线性相关性(r=0.8926,p<0.00001:线性相关性很强)。
Tpm是一种细丝相关蛋白,共有几种可以与cTnT和α-actin相互作用以调控肌肉收缩的蛋白质亚型。作者在先前的研究中证实了人类心脏中存在α-Tpm、β-Tpm、和κ-Tpm,其中α-Tpm是表达最为丰富的亚型(Ying Ge, et al. J Muscle Res Cell Motil. 2013;34(3-4):199-210)。在本项研究中,未磷酸化的α-Tpm、单磷酸化的α-Tpm(pα-Tpm)和单磷酸化的κ-Tpm(pκ-Tpm)是主要检测到的TPM亚型(图5a),而未磷酸化的κ-Tpm、γ-Tpm和skβ-Tpm丰度较低。与正常供体组相比,skβ-Tpm在ICM组中的表达显著降低,而α-Tpm和κ-Tpm在两组比较中无显著变化(图5c)。γ-Tpm的丰度太低,致使很难对其进行准确定量。尽管Tpm亚型的比例变化对心脏功能的影响还不得而知,但skβ-Tpm在ICM组中表达水平的显著降低同样也在先前HCM患者心脏中观察到(Ying Ge, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2020;117(40):24691-24700),因此有理由推断skβ-Tpm表达水平的变化可能会改变心脏功能,并使得ICM患者心脏收缩功能受损。除此之外,在正常供体组和ICM组中也都检测到了α-actin的两种亚型:骨骼肌α激动蛋白(Skeletal α-actin,α-SKA)和心脏α肌动蛋白(Cardiac α-actin,α-CAA),如图5b所示。它们在心肌中共表达,在肌节结构和完整性中具有重要作用。与正常供体组相比,实验观察到α-SKA在ICM组中的表达显著增加(图5d)。结合作者先前观察到α-SKA在非衰竭供体心脏中的表达显著增加(Ying Ge, et al. Anal Chem. 2015;87(16):8399-8406),实验结果说明衰竭心脏中表达上调的α-SKA可以作为一种有前景的心脏病生物标志物。
图5. Tpm和α-actin不同亚型的表达。(a)Tpm在正常供体(蓝色)和ICM(红色)中的代表性去卷积质谱图,共鉴定到α-Tpm、β-Tpm、κ-Tpm和γ-Tpm四种亚型,红色p表示单磷酸化和双磷酸化;(b)α-CAA和α-SKA在正常供体(蓝色)和ICM(红色)中的代表性去卷积质谱图;(c~d)依据AUC进行Tpm和α-actin亚型的定量,两组在p<0.005时被认为有统计学差异。
作者也对Z盘蛋白质进行了鉴定和定量,例如MLP和Cal-1。图6a和图6c分别对应两种蛋白质的去卷积质谱图,其中MLP为未磷酸化和单磷酸化形式(pMLP),Cal-1则表现出多种磷酸化proteoforms,包括单磷酸化(pCal-1)、双磷酸化(ppCal-1)和三磷酸化(pppCal-1)。与正常供体组相比,实验观察到MLP和Cal-1的总磷酸化水平在ICM组中的表达显著增加,分别增加了27%和4%(图6b和图6d)。MLP和Cal-1都与心肌病的发病相关,但目前尚未清楚PTMs如何影响其中的分子机制。本项研究首次揭示了ICM患者中MLP和Cal-1的磷酸化水平增加,但两者的总磷酸化水平呈负线性相关,说明它们不太可能被相同的激酶磷酸化或是在Z盘上有着密切的相互作用。
图6. MLP和Cal-1在ICM组中的磷酸化水平增加。(b)MLP在正常供体(蓝色)和ICM(红色)中的代表性去卷积质谱图,红色p分别表示单磷酸化的MLP;(b)MLP总磷酸化的计算,两组在p<0.01时被认为有统计学差异;(c)Cal-1在正常供体(蓝色)和ICM(红色)中的代表性去卷积质谱图,红色p、pp和ppp分别表示单磷酸化、双磷酸化和三磷酸化的Cal-1;(d)Cal-1总磷酸化的计算,两组在p<0.05时被认为有统计学差异。基于质谱的Top-down蛋白质组学技术,本研究对供体和ICM心脏组织中的proteoform图谱进行了详细分析,观察到多个蛋白质在表达和修饰水平上发生了显著改变,总的结果在proteoform层面揭示了与晚期缺血性心力衰竭相关的分子变化。值得注意的是,作者发现cTnI和ENH2磷酸化水平在ICM组中协同降低,表明缺血性心力衰竭时PKA信号通路出现异常。此外,在ICM组中也观察到了MLP和Cal-1这两种Z盘蛋白磷酸化水平的显著增加,并且也检测到了ICM组中Tpm和α-actin不同蛋白亚型的表达变化。总的来说,本研究强调了在proteoform水平研究ICM的必要性,有助于揭示ICM的发病进程和开发可行的治疗方案。
撰稿:陈昌明
编辑:李惠琳
原文:Defining the Sarcomeric Proteoform Landscape in Ischemic Cardiomyopathy by Top-Down Proteomics
李惠琳课题组网址www.x-mol.com/groups/li_huilin
参考文献
1. Chapman EA, Aballo TJ, Melby JA, et al. Defining the Sarcomeric Proteoform Landscape in Ischemic Cardiomyopathy by Top-Down Proteomics. Journal of Proteome Research. 2023, 22 (3): 931-941.
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