现任西南医院西南癌症中心流式平台负责人,主要从事流式细胞平台的运行管理、用户培训以及流式细胞分选及分析工作。目前,承担省部级课题一项,参与多项国家级课题。以第一或通讯作者发表流式细胞术相关SCI论著2
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本期,西南医院西南癌症中心流式平台负责人马清华副研究员带我们了解FSC与SSC在流式细胞术中的应用。
FSC与SSC在流式细胞术中的应用
作者:西南医院 马清华 副研究员
流式细胞术利用细胞大小和粒度定义细胞群特征。细胞大小用前向散射光FSC(Forward Scatter)测量,细胞的粒度用侧向散射光SSC(Side Scatter)测量。FSC收集细胞折射后向前散射的光,所以FSC除了测量细胞大小,还与核质比、膜形貌和其他细胞特征相关;SSC收集垂直于激光束的散射光以及细胞内部颗粒的散射光,所以SSC可以反映细胞复杂性和粒度,如下图。
1.细胞亚群的分类
FSC和SSC一般以线性模式运行,范围从0到250000。大细胞具有较高的FSC和SSC值,位于FSC/SSC图的右上部分(如粒细胞)。红细胞等小细胞具有较低的FSC值,由于实验中红细胞已被溶解,其碎片出现在散点图左下角;淋巴细胞是小细胞,颗粒不大,因此FSC和SSC值较低。单核细胞更大,颗粒更大,细胞群在FSC轴上进一步向右移动,在SSC轴上向上移动一点,因此它们的FSC和SSC值更高。顾名思义,粒细胞是颗粒状的,也很大,所以它们有很高的FSC和SSC值。
2.判定细胞活性状态
FSC/SSC不仅可以对细胞群进行分类,而且有助于排除细胞碎片和死细胞, 用于细胞活性状态的判定。通常死细胞与细胞碎片的FSC和SSC较低,而凋亡细胞的FSC会变小SSC变大。如下图,通过FSC与SSC判断,A图细胞活性差,基本是死亡细胞与凋亡细胞(P1门内为89.6%);B图中细胞群分为两群,P1门中的细胞群为凋亡及死亡细胞(27%),P2门中的细胞活性状态好。FSC/SSC常被应用于判定分选前及检测时的细胞活性状态、分选后细胞的活性状态以及原代细胞提取的活性状态。
FSC/SSC是否能够真实的反应细胞死活状态呢,我们用7AAD对B图的细胞进行分析,从下图可以看出P门中有95.2%的7AAD-细胞,而P1门中有52.5%的7AAD-细胞。虽然P1门中有52.5%的7AAD-细胞,但是从图中可以发现其细胞大部分集中于左下角。这与7AAD的染色原理有很大的关系。7AAD 是经典的核酸染料,判断细胞的活性通常依赖于其插入DNA。7AAD不能穿透完整的细胞膜,但可以通过细胞凋亡过程中形成的膜裂口和孔隙。7AAD可以使任何缺乏完整膜的细胞都能被核染色。但是,在严重受损的细胞后期如细胞凋亡的晚期,只有含有核酸的凋亡小体才能够被7AAD染成阳性,其余的细胞碎片没有或含有低的DNA含量,这部分群体将会成为7AAD-群体事件。所以FSC/SSC可以用于判定活死细胞。
3.排除细胞双链体
FSC与SSC信号脉冲由信号处理器把脉冲信号高度(Height)、面积(Area)和宽度(Width)定量为一定的数值。这些数据有流式细胞仪的配置计算机工作站进一步分析处理。因此,可以通过面积信号、宽度信号、高度信号对双链体的细胞进行处理。一般用FSC-H/FSC-A、FSC-H/FSC-W以及SSC-H/SSC-W处理双链体细胞。
小结
FSC与SSC是流式细胞术的基本术语。科研工作者充分利用好FSC/SSC,能够轻松的判断分选及检测前细胞活性状态、细胞分选后细胞活性状态、免疫细胞分群等,同时还可以利用FSC/SSC去除细胞中的黏连体细胞。
【个人简介】
西南医院西南癌症中心流式平台负责人 马清华 副研究员
现任西南医院西南癌症中心流式平台负责人,主要从事流式细胞平台的运行管理、用户培训以及流式细胞分选及分析工作。目前,承担省部级课题一项,参与多项国家级课题。以第一或通讯作者发表流式细胞术相关SCI论著2篇,参与多篇高分SCI论著的发表,并参编专著 1 部。
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