一山怎能容二虎？

俗话说的好，一山怎能容二虎？在我们日常实验时，这个道理也同样适用。有实验经验的小伙伴都知道，在HPLC分析中，如果色谱柱性能正常，样品浓度适宜，分析方法合适，色谱峰在出峰时间较短的条件下，峰型应对称而尖锐，如下图1所示。 

（图1）

（图2）

如果色谱柱在使用过程中发现每个峰的峰形都出现问题，先考察是否有连接问题。管线可能太长或太短，这种情况可能导致渗漏或峰分叉/拖尾。如果管线太长，密封圈位置不当，将发生渗漏。如果管线推出的距离不够，将会产生一段死空间，形成混合腔，导致柱外体积，使峰形变坏。

如果在样品分析时发现每个色谱峰都有双峰出现，尤其在采用单一纯物质时，所有的接头都是正常连接，则可以确定是色谱柱出现问题了，一般是柱头受损或者柱头固定相污染引起的。

如果进样量少，原来色谱柱正常，色谱峰的形状多为一大峰带一小峰，不一定拖尾，这一般应是柱头受堵，将色谱柱反过来接，用流动相冲洗或酸洗或其它溶剂，将堵在柱头的残留物冲掉，再反过来，一般情况下就行了。当然不反冲，正冲有时也会正常的。

如果峰拖尾，双峰强弱相差不大，柱头固定相变脏或流失可能性更大，建议按照说明书进行日常或异常的再生冲洗。如果冲洗无法改善出峰情况，建议联系色谱柱厂商进行排查或维修。

如果样品基质比较脏，使用一段时间之后，发现的峰分叉或拖尾等问题，很有可能是保护柱失效造成的。一般粗略判断标准，塔板数、压力或分离度的改变超过10%，就需要更换保护柱了。保护柱是消耗品，建议直接更换，不需要再生。 

当用溶剂极性强度大的试剂，如纯甲醇、纯乙腈，纯乙醇，而分析体系中以水为主时，如果样品进样量大，如定量管为20μL，此时单一的纯物质会出现双峰，第二峰比di一峰小（每次都不太一样），且拖尾，保留时间会提前（相对进样量少而言），将进样量减少一半以上，峰型将变为正常。这是样品的溶剂与流动相极性相差太大，而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的溶剂效应问题，该情况的异常建议用流动相作为稀释剂或减少进样量以消除溶剂效应。

另一个原因是，进样量不一定大，但jue对量很大，色谱图上的双峰紧靠在一起，基本上齐高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色谱柱问题）。将样品稀释再进样就可以了，这是由于进样量过大，色谱柱过载造成的。

目前HPLC分析多为反相色谱，流动相多为甲醇、乙腈、水，加各种添加剂以改善分离性能。样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解，zui佳的溶解方法是用流动相溶解。在实际分析中，有时候为了样品的溶解性或稳定性加入了一点的缓冲液，缓冲液的酸碱性可能会导致样品转化，从而产生双峰现象。此时需要更换缓冲液，调整溶剂pH值，或者用流动相配置样品。

此外，样品要现配现用，避免样品溶解液的有机相比例、pH值发生变化而导致的溶剂效应。

有些样品由于其化学结构的特点，存在互变异构现象，而这种互变异构体无法分开，而是以一个动态平衡存在。在色谱分析时，在一个特定的条件下（如pH值、流动相极性、温度等），一种物质将出现双峰，双峰靠的很近，基本齐高，不拖尾，条件稍一变化，尤其pH，双峰现象将消失。

体系pH值对色谱双峰的影响出现在各个环节上（前面已经提到），尤其在缓冲液流动相平衡过程中其影响更为明显。当连续进样时，受pH的连续变化影响会经常遇到这种双峰的情况。另外，在样品分析时，流动相的pH尽量远离被分析物的等电点，否则也容易引起双峰的产生。在用离子对试剂分析时，选择不好条件也会容易引起双峰的产生。