韩春雨团队开发"免退火"PCR平台系统：更高灵敏度和效率

Argonaute 蛋白的特点是高效的指导 DNA/RNA 定向结合目标核酸。 

2022年2月22日，河北科技大学韩春雨团队在预印版bioRxiv 在线发表未经同行评审的题为“Introducing an argonaute-facilitated PCR platform”的研究论文，该研究设计了一个 argonaute 促进的 PCR 平台，利用源自 Mesorhizobium japonicum的 argonaute (MejAgo) ，该平台不携带核酸酶活性并在结合时暴露引导 DNA 的 3' 端。 

MejAgo-PCR 平台的每个反应循环都由变性步骤和聚合酶介导的延伸步骤组成，省略了传统 PCR 所需的退火步骤。更重要的是，MejAgo-PCR 可以显著提高 PCR 在模板检测中的灵敏度，这是由于向导 DNA/引物和模板之间的 argonaute 促进配对。因此，argonaute 促进的 PCR 具有发展为具有更高灵敏度和效率的PCR 平台的潜力。

另外，2022年1月21日，河北科技大学韩春雨团队在Nucleic Acids Research（IF=17）在线发表题为“A Cas6-based RNA tracking platform functioning in a fluorescence-activation mode ”的研究论文，该研究利用这一特性设计了一个基于 Cas6 的开关平台，用于在体内检测目标 RNA。将split-Venus片段与内切核糖核酸酶突变的大肠杆菌 Cas6 (dEcCas6) 的两端结合，允许配体 (CBS) 激活分split-Venus互补。该研究将此平台命名为基于 Cas6 的荧光互补 (Cas6FC)。在活细胞中，Cas6FC 可以检测几乎没有背景噪声的目标 RNA。此外，只要在感兴趣的 RNA 中标记一个 CBS (29nt) 副本，就能够打开 Cas6FC 荧光，这大大降低了目标 RNA 构象和定位的潜在改变的可能性。因此，该研究开发了一种新的 RNA 跟踪平台，其固有地具有高灵敏度和特异性

聚合酶链式反应（PCR）的发明极大推进了现代生物学研究。此外，鉴于测试追踪和隔离策略 (TETRIS/TTI) 是迄今为止控制传染病的最有效方法，PCR 已广泛用于医疗保健服务。一个明显的例子是在当前 COVID-19 大流行中使用 PCR 检测受感染但无症状的个体。尽管出现了许多核酸检测新技术，但世界卫生组织建议，基于定量 PCR (qPCR) 的检测平台仍被认为是 COVID-19 检测的黄金标准。

核酸扩增是包括传统PCR在内的所有已开发的核酸检测系统的基础。也不例外，最近开发的SHERLOCK系统利用了重组酶-聚合酶扩增 (RPA)。因此，某个检测系统的灵敏度取决于其依赖扩增策略的灵敏度。从这个意义上说，虽然 SHERLOCK 系统具有混杂 RNAse 活性的“附带效应”，但最初的 RPA 促进的扩增决定了随后的 Cas13a 介导的二级信号放大的可靠性。因此，如果目标模板的滴度低于 RPA 灵敏度的阈值，则 SHERLOCK 声称的优势是不存在的。

传统的 PCR 是一种异热反应，使用重复的加热和冷却循环来复制特定区域的 DNA。相比之下，等温扩增发生在稳定的温度下，这显然具有无需设备、省时和便携的许多优点。RPA 促进的 PCR 是一种等温反应，其中 UvsX 重组酶携带引物并促进其与双链 DNA (dsDNA) 模板的配对。RPA 采用重组酶-引物复合物扫描双链 DNA 并促进同源位点的链交换，省去了传统 PCR 所需的高温变性过程，从而可以进行等温扩增。

然而，RPA 平台还需要单链 DNA 结合蛋白，该蛋白相互作用并防止移位的模板链通过分支迁移弹出引物。此外，重组酶反应需要 ATP 的存在用于能量输入。此外，重组是一个复杂的过程，其机制尚未完全解决。因此，对于用于 RPA 平台的引物的优化，尚未建立明确的规则。因此，在应用RPA时，不可避免地需要额外的引物筛选过程，这显然是费力的。

无论扩增过程是异温还是等温，引物与模板的结合是扩增的第一步，结合的效果决定了后续扩增的灵敏度。传统PCR的引物-模板配对过程完全依赖于引物和模板之间的随机物理相互作用。在这种依赖热力学定律的系统中，增加引物浓度肯定会提高与模板配对的效率。然而，由于引物之间以及引物和模板之间的非特异性错配，必须考虑对准确性的权衡影响。

Argonaute 蛋白可以高效地引导 DNA/RNA 定向结合到靶核酸。对argonaute促进靶向机制的研究表明，argonaute蛋白可以加速引导与靶核酸的结合。在这项研究中，证明了源自Mesorhizobium japonicum的 argonaute (MejAgo)  可用于增强引物-模板配对。借助此功能，MejAgo 促进的 PCR 系统可以提高核酸检测的灵敏度。

参考消息：

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.02.22.481407v1