Science│ 沈炳辉团队揭示细胞如何在DNA复制压力下求生存

复制压力是DNA复制过程中的障碍, 可以减慢或者停止复制叉的行进过程。这些压力主要来自以下四个方面：DNA复制机制自身缺陷, DNA序列中自身难以复制区域包括端粒和中心粒区域的重复序列, 变异细胞 (肿瘤) 中基因组复制的高度需求, 和外部压力包括高温或药物处理。DNA复制缺陷的细胞如何获得突变, 从而逃逸在DNA复制压力下的细胞凋亡, 是一个生物学界长期未解的问题。

2021年12月2日, 美国希望城国家医学中心 (City of Hope) 沈炳辉 (Binghui Shen) 实验室在Science杂志发表题为 Error-prone, stress-induced 3' flap-based Okazaki fragment maturation supports cell survival 的文章。该研究报道了敲除结构特异性内切酶FEN1/RAD27基因的酵母细胞在限制性温度下激活一条新的易错的冈崎片段成熟通路 (Okazaki fragment maturation)。限制性温度压力激活Dun1, 促进未加工的5' flap转变为3' flap, 进而被Pol δ等3' 核酸酶去除。然而, 3' flap在某些区域并不被降解, 而是形成二级结构, 促进3' 端延伸, 产生在两个重复序列之间与模板序列反相的小片段。这样一种新的重复序列突变称为非典型的重复序列突变(alternative duplication mutation)。一旦DNA复制酶Pol δ基因内出现这种重复序列, 细胞会失去形成5' flap的能力, 而是以高突变率为代价, 抑制rad27Δ细胞在限制性温度下的死亡。这一研究揭示了一种全新的应激诱导的、易错的冈崎片段成熟途径, 解释了突变细胞株产生突变, 抵消复制缺陷, 促进细胞进化和生存的过程。

在DNA复制过程中, 后随链的复制是不连续的, 由冈崎片段连接而成。在冈崎片段成熟过程中, RNA片段和由Pol α合成的DNA片段会形成5' flap, 进而由FEN1或DNA2和FEN1合作切除。FEN1的缺失会积累未加工的5' flap, 阻止冈崎片段的连接, 导致复制叉的坍塌和DNA双链断裂。缺失FEN1同源蛋白Rad27的酵母细胞在许可温度 (30℃) 下生长缓慢, 在限制性温度 (37℃) 下致死。这种表型称为条件致死。长时间培养后, 有极少部分细胞在37℃条件下幸存。这类细胞株称之为回复突变体 (Revertant)。通过单克隆的全基因组测序, 发现在回复突变体中21个基因发生了突变, 但其中只有Pol δ的催化亚基Pol3的突变率为100%。后续的Sanger测序发现, 31个独立的回复突变体中都含有Pol3的突变。敲入 (knock-in) Pol3的突变至rad27Δ细胞中, 细胞生长速率、突变率、突变图谱都和野生型相似。

有趣的是, 全基因组测序在回复突变体细胞中发现了非典型的重复序列突变图谱, 这些序列可以形成三种类型的发卡结构 (图1)。在此模型中, 5' flap首先转变为3' flap, 3' flap退火形成互补序列, 3' flap延伸继而连接成非典型的重复序列突变。

图1. 三种类型的非典型重复序列突变的形成原理

基于对非典型重复序列突变形成机制的了解, 作者相信3' flap在体内的存在。运用作者新研发的检测基因组3' flap的方法 (图2) 发现, rad27Δ细胞基因组只有在37℃条件下形成大量的3' flap。而rad27Δ细胞在30℃条件下或野生型细胞在任何温度下都只有极少量的3' flap。

图2. 基因组DNA中3' flap检测方法和结果A. 绿色点表示在双链DNA中的3'端被封闭。红色星号表示单链DNA中3'端被放射性标记。B. 3' flap只出现在高温培养条件下的rad27细胞中。

这样一种从分子水平上像火山爆发型的基因组重组事件, 必须把rad27Δ突变细胞的细胞周期停止在S期的后期。高通量基因表达组学研究发现在37℃条件下rad27Δ细胞的中的Mec1, Rad53和Dun1转录水平明显升高。敲除DUN1基因导致rad27Δ细胞在37℃条件下3' flap的形成、突变率和回复突变子的形成频率大幅下降。

基于以上结果, 作者提出了细胞在遗传缺失和高度DNA复制压力下冈崎片段成熟的易错加工的新型模型 (图3)。当细胞缺失结构特异性内切酶FEN1/RAD27时, 残留的5' flap可以转化为更具活性的3' flap。一旦单链的3' flap形成二级结构, Pol δ便以此为引物, 补齐空缺序列, 并把重复序列连接起来, 形成非典型的重复序列突变子。细胞用突变作为代价, 求得了生存。这些发现为新型的抗癌药物开发提供了重要的理论基础和崭新的方向。

图3. 冈崎片段成熟的易错加工新型模型

City of Hope 博士后孙海涛为该文章第一作者, 沈炳辉教授和郑力教授为该论文的共同通讯作者。加州理工大学的Judith L. Campbell教授, 加州大学圣塔芭芭拉分校的Eric Zheng, 沈郑团队的Amanpreet Singh, 周亚竟, 路兆宁, 周棉博士为本文的共同作者。希望城国家医学中心的顾朝辉和吴锡伟团队提供了高通量测序数据分析, 为本文共同作者。中国农业大学的楼慧强教授及实验室的刘路, 邹友龙, 李晓丽和张晶晶博士, 加州理工大学的Martin E. Budd博士为本研究提供了酵母遗传学的实验技术指导。加州大学圣地亚哥分校的Richard Kolodner教授, 华盛顿大学医学院的Peter M.J. Burgers教授, 德克萨斯大学的Satya Prakash和Louis Prakash教授, 加州大学的Wolf-Dietrich Heyer教授和爱荷华大学的Marc S. Wold教授为本研究提供了重要的实验材料。南京师范大学郭志刚教授团队, 浙江大学医学院夏大静教授团队, 澳门大学沈汉明教授团队在本课题前期探索性阶段给予了大力支持。

上述工作为沈郑团队在过去二十五年来, 在冈崎片段成熟和DNA损伤应答机制研究工作的积累。欢迎生物信息学, 分子细胞生物学和生物化学等相关专业的有志青年加入团队, 开展进一步的合作研究。

原文链接：

http://doi.og/10.1126/science.abj1013