真菌毒素多重检测技术研究进展

真菌毒素是真菌在适宜条件下产生的一类小分子次级代谢产物，目前已知的真菌毒素约有400多种。研究表明，大多数真菌毒素可抑制动物体内蛋白的合成，破坏细胞结构，进而影响动物体肝脏、肾脏、神经、造血等组织器官的正常运作，具有强烈的致癌、致畸、致突变作用，对人和动物的生命与健康造成重大威胁。

由于农产品作物生长、收获、贮藏及运输中都易受到产毒真菌的侵染，且所产生的真菌毒素在加工处理过程中不易被清除，因此，真菌毒素污染被认为是不可避免的污染问题。更为重要的是，多重产毒真菌可能侵染同一农产品，同时侵染的产毒真菌往往可以同时产生多种真菌毒素，因此在农产品中多种真菌毒素的共存成为一种不可忽视的必然现象，这就需要建立真菌毒素的多重检测技术。军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所的陈瑞鹏、周焕英*、高志贤*等人综述了近5 年真菌毒素多重检测技术的研究进展，主要包括高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法、免疫层析法、化学比色法、电化学法、化学发光法、荧光法等，分析了这些方法在真菌毒素检测中的应用与亟待解决的问题，并对其未来的发展应用前景进行了展望。

1、高效液相色谱-串联质谱法

HPLC-MS/MS法集中了色谱的分离性能与质谱的分子确证优势，其在检测器阶段利用质量分析器对待测物进行二次选择，将离子丰度转换为可定量计算的峰，同时提供被测物的质量数与分子结构信息，具有稳定性好、灵敏度高、专一性强、再现性好等优点，已经成为分析检测多组分真菌毒素的主要方法。

样品前处理是指对目标物进行提取、富集和净化的步骤，以减少杂质干扰，提高检测灵敏度。目前常采用的样品前处理方法有一步提取法和分散固相萃取QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）法。Zhao Hongxia等利用HPLC-MS/MS法同时检测植物油中的16 种真菌毒素，首先采用一步提取法对目标物进行提取：使样品经体积分数85%乙腈溶剂提取和C18吸附剂处理，随后将目标物在多反应检测模式下的保留时间和离子对信息进行定量分析，该方法对16 种真菌毒素的加标回收率为72.8%～105.8%，检出限为0.04～2.9 ng/mL。

2、免疫层析法

免疫层析法是指将识别元件（抗原）和采用胶体金、磁珠、荧光微球等标记的捕获元件（抗体）固定在硝酸纤维素膜上，标记物作为信号指示物的检测方法。在分析时，待测液溶解标记的抗体在毛细管作用下沿着试纸条迁移，结合区域产生颜色、荧光等信号变化定性或定量分析多组分真菌毒素。免疫层析法根据目标物的大小分为双抗夹心法和竞争法，其中真菌毒素是单一抗原表位的小分子物质，适用于竞争免疫分析法。

3、化学比色法

化学比色法是指利用待测物与化学试剂之间发生明显的化学显色反应，通过与标准品比较颜色或在一定波长处比较吸光度，从而对待测物进行定量检测的方法。化学比色法中的显色反应通常具有较高的灵敏度和选择性，反应生成的有色化合物性质稳定，颜色差异明显。具有成本低廉、操作简单、检测迅速、结果直观等优点，已经广泛应用于真菌毒素的多重快速检测中。

在近5 年内，化学比色法基于金纳米粒子独特的光学性质开发的多重检测真菌毒素在选择性、灵敏度、快速性和便携性等方面有了显著改善，但还存在一些需要解决的问题：由于对待测物自身的化学性质依赖性较强，在检测过程中易受到外部环境的干扰，影响检测结果的准确性。该问题可以通过提高金纳米粒子的稳定性，基于其表面等离子体对应光谱偏移的颜色变化进行检测，增加检测方法准确性；使金纳米粒子信号可控放大，对真菌毒素进行更准确的定量分析。

4、电化学法

电化学法是根据电解质溶液中物质的电化学性质及其变化规律，建立在电学量（电流、电位、电阴或电量）与待测目标物之间的计量关系的基础上，对目标物进行定性或定量分析的方法。具有灵敏度高、选择性好、分析速度快、易于自动化、操作简便等优点，在真菌毒素的多重检测中有着广泛的应用。

近5 年电化学法在多重检测真菌毒素的灵敏度和特异性方面得到了极大的提高。但是目前仍然存在一些急需解决的问题：1）样品前处理的过程比较费时费力，需要进一步简化样品的前处理流程；2）电化学传感器的分子识别元件的稳定性、使用寿命以及非特异性结合能力有待进一步提高；3）电化学信号指示剂的种类有限，需要研发更多的电化学信号指示剂。

5、化学发光法

化学发光是指由化学反应引起的发光现象。化学发光法是指利用化学发光反应，对化学发光物质由激发态跃迁回基态时发出的光信号进行检测分析的方法。该方法在检测过程中不需要外加光源，可以避免其他光源产生的干扰以及带来的其他误差，具有操作简便、易于实现自动化和分析速度快等分析检测的优点，已广泛运用于真菌毒素的多重检测分析中。

目前在实际应用中化学发光法仍然存在几个问题：1）化学发光剂和增强剂种类较少，急需研发更多的化学发光剂和增强剂来拓展化学发光法的应用范围；2）发展化学发光法和传感技术、毛细管电泳技术等联用，扩大化学发光法在真菌毒素检测分析中的应用；3）研发化学发光法仪器设备的小型、便携式、自动化和一体化，有助于推进化学发光仪器的商业化。

6、荧光法

荧光法是利用待检测物经外加频率的紫外线照射后，激发出能够反映其特性的荧光，通过微孔板荧光仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜和荧光分光光度计等仪器检测荧光强度，从而实现对待检测的定量分析。荧光分子可以在很短的时间内被大量反复的激发和监测，量子产率较高，具有灵敏度高、选择性强和定量精准等优点，已广泛应用于真菌毒素多重检测中。

近5 年荧光法多重真菌毒素的检测时间缩短且灵敏度得到极大改善，但是大多数常用的荧光团的荧光寿命以秒为单位，并且需要特定的储存条件来稳定其荧光响应，目前荧光法还未应用于多重真菌毒素的现场检测分析中。目前荧光分析法主要呈现以下几个趋势：1）针对自身无荧光物质，研发反应活性高、量子产量大的荧光探针，从而拓宽检测的领域；2）针对不同基质及目标化合物，探索最佳提取方式以及净化手段，实现最佳回收率及特异性；3）将荧光分析技术与光学、电化学等多方面技术结合，构造成集成便携式的综合检测体系，实现实时同步获得检测和分析的信息。

7、拉曼光谱法

拉曼光谱是光穿过透明介质时由于分子的非弹性散射使光频率发生变化而产生的一种散射光谱。拉曼效应是光子与光学及声子相互作用的结果，拉曼散射光谱可以获取分子振动能级与转动能级跃迁的特征信息，具有强大的分子识别能力，是分子信息快速获取的理想手段。但常规拉曼散射强度比较弱，灵敏度不高。表面增强拉曼散射（SERS）极大地克服了常规拉曼光谱灵敏度不高的不足同时又保留了拉曼光谱的实时、快速的特点，已被广泛应用于真菌毒素多重检测中。

8、其 他

目前也有一些其他技术广泛应用于真菌毒素的多重检测中。已知传统真菌毒素检测方法与智能手机的结合是达到便携化的一个良好手段，因此，基于智能手机图像处理的平台，寻找一种配套检测与编码的载体，使其编码信号清晰、可变、容量高、检测信号灵敏具有重要的现实应用意义。

结 语

本文重点介绍了近5 年真菌毒素多重检测技术的研究进展，主要检测方法有HPLC-MS/MS法、免疫层析法、化学比色法、电化学法、化学发光法、荧光法等，分析比较了这些方法在真菌毒素多重检测中的优缺点。