荧光定量PCR之RNA提取及质量评估

分子生物学研究对提取RNA要求较高，纯度高、完整性好、含量高的RNA是获得实验成功的关键和前提。小编给各位小伙伴总结了以下RNA提取常见问题及RNA质量的评估方法：

常见的RNA提取方法有异硫氰酸胍-苯酚法（Trizol法）、离心柱法和磁珠法。Trizol法是动物组织及动物细胞总RNA提取最常用的方法。Trizol法裂解能力较强，尤其适合小样本及特别难提取的组织，如皮肤，动物结缔组织等总RNA的提取；另外Trizol作为一种通用型的裂解试剂，还可以用于植物组织、细菌、真菌等组织的提取。离心柱法是一种十分稳定的RNA提取方法，电泳条带较为均一，但分子量较小的RNA会被过滤掉。磁珠法是使RNA与纳米磁珠结合，在磁场作用下，磁珠-核酸复合物与液体分离，再把核酸从磁珠上洗脱下来。对于含多糖多酚的植物组织如油茶、茶叶、油菜等还可以使用CTAB法进行总RNA的提取。那么在RNA提取过程中如何防止RNA降解，保证RNA质量？

如何避免RNA降解？

1.避免RNA酶的产生：

A 、避免内源性RNAase：

内源性RNAase是造成RNA降解的最重要原因。收集样本时，内源性RNA酶释放，降解RNA，降解速度与酶含量和温度有关，所以收集样本时必须马上进行内源RNA酶的失活。内源性RNAase失活方法：①迅速研磨破碎后加入裂解液中保存；②立即切成小块投入液氮中保存；③使用RNAlater保护剂等。

B、避免外源性RNAase：

使用无RNase的塑料制品和枪头，玻璃器皿要消毒避免交叉污染，注意：戴帽子、戴口罩、橡胶无菌手套，在清洁灰尘少的试验台提取。

2.提高RNA提取效率：

A 、组织RNA提取：

选用新鲜组织，这样RNA提取的效果比较好；如果不是新鲜的(最好在半年之内，-80℃或者液氮中冻存的)组织，注意不要反复冻融，从冰冻状态拿到0-4℃，待组织解冻后，用DEPC泡过的剪刀剪一小块组织，称重后，放到预冷的匀浆器中，进行匀浆处理。注意：速度不要太快，要有间隙，否则由于摩擦产热，RNA遇热会加速降解。如果一次做多个标本的RNA提取，也要这样做，更不能急。后面的步骤和细胞RNA提取一样。

B、培养细胞的RNA提取：

贴壁细胞，需要先用胰酶消化后，然后收集到离心管中，离心，去上清然后用PBS多洗2-3次，以去除多余的胰酶。悬浮细胞，直接用吸管或者加样枪吹打，以使细胞基本可以被吹下来。然后离心去上清，不需要用PBS洗。

如何确认RNA质量的好坏?

1. RNA溶液纯度的检测：

RNA溶液在280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般我们通过OD260/OD280的值来判断RNA纯度：

OD260/280的值在1.9-2.1之间，认为RNA纯度较好；

OD260/280的值小于1.8时，表明蛋白质杂质较多；

OD260/280的值大于2.2时，表明RNA已经降解；

注意：如果用TE溶液洗脱RNA，会使OD260/280的值偏大。

2. RNA完整性的检测：

1）通过琼脂糖凝胶电泳检测28s和18s条带，28s条带宽度为18s条带的两倍；

2）通过色谱方法检测，RIN值：28s/18s为1.8-2.0，表明RNA完整性较好，基本无降解发生。

RNA电泳带型的特征：

☑RNA应该呈现出3条rRNA带。分别是5、18、28SrRNA条带。

☑28s亮度是18s亮度的一倍，其他比例关系均提示RNA有一定程度的破坏。

☑不能有多的带出现，出现多的带有两个可能:一是DNA污染带;二是rRNA破坏断裂带。

☑rRNA之间可以看到很淡的、雾蒙蒙的mRNA拖带。

☑ 琼脂糖凝胶被RNAase处理后电泳带基本消失，没有明显的、边缘清晰的带残留(如果有残留就是明显的DNA污染，而且是很大量的 DNA污染。

参考文献：

[1]Vermeulen J, De Preter K, Lefever S. Measurable impact of RNA quality on gene expression results from quantitative PCR[J]. Nucleic Acids Res 39 2011 :e63.

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