新冠病毒德尔塔变异来势凶猛 中国计量院开发突变株基因组RNA标准物质

当前，新冠病毒疫情仍然在全球范围内肆虐，截止到8月20日，全球感染人数超2.09亿，死亡人数达440万【1】。我国疫情虽然得到了较好的控制，但当前防控工作内防反弹，外防输入，形势依然非常严峻。尤其是去年12月报道发现了英国B.1.1.7突变毒株，S蛋白与人ACE2受体结合亲和力提高了1000倍，传播速度比之前的毒株高达70%，很快就成为了英国的主要毒株【2】。而首次报道在印度发现的突变株B.1.617.2比英国突变株的突变位点更多，传染性更强【3】。

美国、以色列等多个国家和地区在不同程度上出现疫情反弹。美国疾控中心数据显示，2021年6月中旬平均每日新增新冠肺炎病例数已下降至约1.1万例【4】；8月1日统计数据显示，过去7天内新增病例超50万例，日均新增7.2万余例，7天内新增死亡超2100例【5】。2021年4月，我国也出现输入型印度变异毒株B.1.617.2亚型。虽然目前的研究表明该突变株尚未对疫苗的有效性产生显著的影响【6】，但针对该突变株的监测和防控工作绝不能放松。

自疫情爆发以来，我国成功抗疫的关键是“早发现、早隔离、早诊治”，早发现的关键是需要有灵敏的检测试剂，目前针对该突变株的检测，最急需的就是开发灵敏、快速的检测试剂盒。虽然基于前期的经验和积累，国内很多企业可以快速开发出针对突变株的检测试剂，但试剂性能评价和方法验证需要具有准确量值的标准物质作为支撑，而目前针对德尔塔突变株（B.1.617.2）的标准物质研究国内外还没有报道。

目前我国已有企业针对突变株B.1.617.2开发检测试剂盒【7】，仍有大量的企业正在进行开发，急需具有针对突变株的标准物质，可以为其提供方法验证和量值溯源。此外，对于新开发的试剂要进行临床应用、申请欧盟的CE认证或美国FDA的紧急授权使用，都需要有可靠的标准物质对其性能进行评估。为此，非常有必要研制相应突变序列的标准物质，为国内IVD企业提供量值溯源，为我国新冠疫情防控提供计量技术支撑。

近日中国计量科学研究院联合北京科兴中维生物技术有限公司，针对新冠病毒德尔塔突变株开发了基因组RNA标准物质。该标准物质以新冠病毒德尔塔突变株为候选物，对其基因组RNA进行纯化、序列表征和量值确定。该标准物质包含了新冠病毒德尔塔突变株的特征突变，可以作为测量标准用于新冠病毒德尔塔突变株检测方法的方法验证、质量控制和量值溯源。

1.新冠病毒德尔塔突变株基因组RNA标准物质序列和量值

该标准物质涵盖新冠病毒德尔塔突变株的全部序列，二代测序结果表明不存在其他病毒序列。采用经过国际比对验证的数字PCR方法，对开放阅读框（ORF1ab）基因、核衣壳蛋白N基因、包膜蛋白E基因和刺突蛋白S基因进行了准确定值。特性量值为每管溶液中含有的新冠病毒德尔塔突变株的ORF1ab、N、E和S基因的拷贝数浓度。具体量值见表1。

表1. 新冠病毒德尔塔突变株基因组RNA标准物质特性量值

该标准物质的基因组序列中S基因具体的变异位点包括了T19R、G142D、R158G、L452R、T478K、D614G、D950N，以及在DEL156-157和DEL679-685位置的缺失突变等，如图1。

图1. 新冠病毒德尔塔突变株标准物质突变位点示意图

2.新冠病毒德尔塔突变株基因组RNA标准物质使用方法

2.1作为外标

该标准物质可以作为测量标准用于病毒核酸的量值溯源。具体使用方法：对该标准物质进行5倍梯度稀释，稀释4-5个梯度后，与待测样本同时进行荧光定量PCR扩增，记录5个梯度对应的荧光定量PCR扩增的ct值。以标准物质梯度稀释后的量值的对数为横坐标，以荧光PCR扩增得到的ct值为纵坐标，进行线性拟合后可以得到标准曲线和线性方程，根据该标准曲线和待测样本扩增的ct值，实现对待测样本的病毒核酸拷贝数进行定量。使用时需要注意：1）标准物质梯度稀释所使用的稀释液应该是具体保护RNA功能的保存液或无RNA酶的水，同时为了保证量值的准确可靠，应尽可能在保护液中添加一定浓度的RNA carrier，2）由于不同的PCR扩增板所获得的ct值通常不具备可比性，因此待测样本应与标准物质同时扩增，这样得到的ct值进行比较会更准确。

2.2方法开发

该标准物质可以用于新冠病毒德尔塔突变株检测新方法的方法开发和建立。该标准物质的序列包括了德尔塔突变株的所有特征突变序列，可以作为测量对象用于特异检测德尔塔突变株的新方法的开发。适用于荧光定量PCR方法、数字PCR方法、环介导等温扩增（LAMP）、基因测序等方法的方法开发。

2.3 方法验证

该标准物质可以作为测量标准用于德尔塔突变株检测方法的方法验证。由于该标准物质的具有明确的量值及不确定度，即新冠病毒四个特征基因（ORF1ab、N、E和S）的拷贝数浓度，所以可以用于对新冠病毒德尔塔突变株检测方法的准确性、检出限和定量限等性能的验证。适用于荧光定量PCR方法、数字PCR方法、等温扩增（LAMP）等方法的方法验证。同时还可以用于验证针对非突变株开发的方法是否存在脱靶。

2.4 质量控制

可以用于实验室日常对试剂和仪器性能的质量控制。实验室在进行正式检测前可以先使用本标准物质进行测试，检查仪器和试剂的状态，从而保证样本检测结果的可靠。还可以将标准物质加入病毒采样管，与待测样本平行处理，参与提取、扩增和检测的全流程，对检测的全部环节进行质量控制和校准。通过对比测量值和标准物质量值，可以对提取效率和检测过程进行校准。

3. 新冠病毒相关核酸标准物质

截至目前，中国计量科学院共研制了体外转录、基因组、假病毒3个系列11种新冠病毒核酸标准物质（表2）【8】。这些标准物质可应用于方法建立、质量控制、仪器校准、试剂性能评估、验证与评价等多方面，为保障核酸检测结果准确、可比、可溯源，提供计量技术支撑。

表2 新冠病毒核酸系列标准物质

【1】https://covid19.who.int/

【2】https://cov-lineages.org/global_report_B.1.1.7.html.

【3】 Raman R, Patel KJ, Ranjan K. COVID-19: Unmasking Emerging SARS-CoV-2 Variants, Vaccines and Therapeutic Strategies. Biomolecules. 2021 Jul 6;11(7):993.

【4】 https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/covid-data/covidview/index.html

【5】https://covid.cdc.gov/covid-data-tracker/#cases_casesinlast7days

【6】Zhao X et al., Nutralisation of ZF2001-elicited antisera to SARS-CoV-2 variants, Lancet Microbe, 2021, https://doi.org/10.1016/S2666-5247(21)00217-2

【7】https://baijiahao.baidu.com/s?id=1699542160613294305&wfr=spider&for=pc

【8】https://www.ncrm.org.cn/