基于成像质谱显微镜(iMScope TRIO)对奥曲肽在小鼠体内动态分布的评价

Pharmacokinetic study based on a matrix-assisted laser desorption/ionization quadrupole ion trap time-of-flight imaging mass microscope combined with a novel relative exposure approach: A case of octreotide in mouse target tissues

Tai Rao _{a, 1}, Yuhao Shao _{a, 1}, Naoki Hamada _b, Yanmin Li _b, Hui Ye _a, Dian Kang _a, Boyu Shen _a, Xinuo Li _a, Xiaoxi Yin _a, Zhangpei Zhu _a, Haofeng Li _a, Lin Xie _a, Guangji Wang _a, _**, Yan Liang _{a, *}

a. Key Lab of Drug Metabolism & Pharmacokinetics, State Key Laboratory of Natural Medicines, China Pharmaceutical University, Tongjiaxiang 24, Nanjing 210009, PR China

b. Shimadzu China Mass Spectrometry Center, No. 16 Chao Yang Men Wai Street, Chaoyang District, Beijing 100020, PR China

　　1. 摘要

　　基质辅助激光解吸电离时间飞行质谱成像技术(MALDI-TOF Imaging)，作为直观反映组织器官中分子水平化合物的空间分布与变化的可视化方法，目前已在基础与临床医学研究中受到广大科研工作者的关注。本研究所使用的成像质谱显微镜(Imaging Mass Microscope, iMScope TRIO)，前端是搭载高分辨光学显微镜的大气压基质辅助激光解吸电离源(Atmospheric Pressure -MALDI)，后端配置离子阱和飞行时间串联质谱仪(IT-TOF)。高分辨光学显微镜以及领先世界水平的 5 μm 空间分辨率，有助于观察和定位到亚细胞水平的组织器官中。IT-TOF 串联质谱仪可以实现高质量分辨率的多级质谱分析，为未知物的结构解析提供丰富的碎片信息。基于 iMScope TRIO 的这些特点，本研究首次应用于直观观测多肽类药物奥曲肽在小鼠体内的动态变化并建立相应的定量方法，其在体内的分布以及清除率首次通过 iMScope TRIO 质谱成像系统得到的数据计算出来。通过对给药组小鼠的胃部切片在不同的时间点的质谱成像观察，我们能够直观的观察到奥曲肽从胃粘膜层到肌肉层的动态转移过程。更重要的是我们发现奥曲肽在小肠里面清除速度非常快，通过清除曲线计算出来的吸收峰值(Tmax)在 40 min 左右，其半衰期(t1/2)在 37.7 min 左右[1]。通过 LC-MS/MS 绝对定量方法的进一步验证，确立了基于 iMScope TRIO 质谱成像的定量方法在药代动力学研究方面的可靠性和实用性。

　　2. 前言

　　在药代动力学研究中，常用的方法是通过液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)系统来对目标药物进行定量和定性的测定，但是这种传统的方法，因其对样品的同质化以及纯化前处理，而无法观察到目标药物及其代谢产物在器官水平的空间分布信息以及动态转移过程。而传统的分子成像技术，如荧光成像，免疫组化成像等，需要对目标物进行标记且不能够反映特定部位的化学组成信息。针对这些问题，一种新型的质谱成像技术：质谱显微镜(iMScope TRIO)应运而生，把光学显微镜和质谱仪精密的结合在一起，既可以对样品进行形态学上的细微观察，也可以得到样品上特定部位的化学信息。其前端是搭载高分辨光学显微镜的大气压基质辅助激光解吸电离源(Atmospheric Pressure -MALDI)，后端配置离子阱和飞行时间串联质谱仪(IT-TOF)。高分辨率光学显微镜的搭载可以实现样品中微小器官的精准定位并选定测定区域，IT-TOF 串联质谱仪实现高质量分辨率的多级质谱分析，为未知物的结构解析提供丰富的碎片信息。本研究中使用 iMScope TRIO 建立了简单且直观的奥曲肽在组织内定量及其动态分布的方法。奥曲肽作为一种天然内源性生长激素抑制素类似物，被广泛的应用于胃肠道出血等临床症状，其药代动力学研究对于阐明其药效药理的基础研究以及制定给药间隔等临床研究都具有重要意义。

　　3. 实 验

　　3.1 材料和仪器

　　MALDI级别的a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA), Sinapinic acid (SA) 和2, 5-dihydroxybenzoic acid (DHB) 购自西格玛公司。奥曲肽和兰瑞肽购自上海广锐生物技术公司。HPLC级别的乙腈和甲醇购自默克公司。25 mm X 75 mm导电载玻片购自德尔塔科技公司。

　　3.2 动物实验

　　通过灌胃的方式小鼠(3周龄Balb/c) 给药50 mg/kg，分别在给药10, 20, 40, 60, 120, 240,和360 min后处死小鼠，并分别取得其相应的胃和小肠组织。用生理盐水清洗胃肠组织，为保证其完整性和组学代表性，立刻用100mg/ml明胶进行包埋，并储存于-80℃冰箱待用。

　　3.3 切片的制作以及基质涂敷

　　使用 Leica CM1950 在-20℃的环境下制作 10μm 厚小鼠胃以及小肠冰冻切片。空白小鼠胃切片加标奥曲肽 5 pmol。通过比较目标物的信噪比(S/N)来优化四种不同组合的基质涂敷方法，分别是 1)升华;2)升华+重结晶;3)喷涂;4)升华+喷涂。基质升华通 iMLayer 自动基质升华仪完成。基质喷涂使用 GSI Creos Airbrush 完成。

　　3.4 基于 iMScope TRIO 的成像质谱分析

　　分析条件

　　3.5 校正样本的制备

　　配置一系列浓度的奥曲肽标准溶液，浓度分别为 2, 5, 10, 20 和 40 pmol/μL, 溶于乙腈水(体积比 1:1, 内含 0.1% TFA)，同时制备 10 pmol/μL 内标兰瑞肽(lanreotide) 溶于乙腈水(体积比 1:1, 内含 0.1% TFA)。5 个浓度梯度的奥曲肽标准溶液分别点于空白组织上。其中 5 pmol/μL 的奥曲肽标准溶液用于验证此方法的精密度。

　　3.6 基于LC-MS/MS的绝对定量

　　分别切取在不同给药时间点的胃肠组织以及空白组织，在水中打成匀浆(50 mg/ml)并去除蛋白。内标兰瑞肽溶液(10 pmol/μL)加入给药组织中。系列浓度标准溶液奥曲肽(2, 5, 10, 20 和 40 pmol/μL)和内标溶液(10 pmol/μL)同时加入空白组织样品中。绝对定量分析通过多反应监测模式(MRM)(奥曲肽 510.5 >120.1，兰瑞肽 548.8 >170.2)岛津三重四极杆液质联用仪 LCMS-8050 完成实验。

　　4. 结果与讨论

　　4.1 基质的选择

图 1. 奥曲肽和兰瑞肽(内标)的结构及其标品质谱图: (A) 奥曲肽 (B) 兰瑞肽

图 2. 奥曲肽和兰瑞肽(内标)在小鼠胃部切片的质谱成像分析。(A) 喷涂基质 DHB 的光学图像。(B) 以 DHB 为基质的奥曲肽(m/z 1019.44)离子密度图。(C) 以 DHB 为基质的兰瑞肽(m/z 1096.47)离子密度图。(D) 喷涂基质 CHCA 的光学图像。(E) 以 CHCA 为基质的奥曲肽(m/z 1019.44)离子密度图。(F) 喷涂基质 SA 的光学图像。(G) 以 SA 为基质的奥曲肽(m/z 1019.44)离子密度图。Scale bar: 50 μm。

　　4.2 基质喷涂方式的优化

图 3. 基于 4 种不同的基质喷涂方法的奥曲肽质谱成像分析及其相应的平均质谱图。(A) 升华。(B) 升华+重结晶。(C) 喷涂。(D) 升华+喷涂。Scale bar: 50 μm。

　　4.3 基于 iMScope TRIO 定量标准曲线的构建

图 4. 内标校正过的奥曲肽浓度标准曲线。(A) 小鼠组织切片的光学图像。(B) 奥曲肽的标准曲线。(C) 奥曲肽分别在五个浓度梯度的质谱成像(C1: 1 pmol, C2: 2pmol, C3: 5 pmol, C4: 10 pmol, C5: 20 pmol)以及相应的内标兰瑞肽的质谱成像(C6-C 10)。

　　4.4 方法精密的考察

图 5. 用校正过得奥曲肽在空白小鼠胃部切片上的质谱平均信号强度验证此方法的精密度。(A) 加标的小鼠胃部切片光学图像。(B) 奥曲肽(m/z 1019.44)离子密度图。(C) 兰瑞肽(m/z 1096.47)离子密度图。(D) 此方法的精密度分析。

　　4.5 奥曲肽在小鼠胃部的空间动态分布及其清除过程

图 6. 小鼠灌胃后10 min (A) 20 min (B) 40 min (C) 60 min (D) 和120 min (E)。其中A1-E1：小鼠胃部切片的光学图像;A2-E2：奥曲肽(m/z 1019.44)离子密度图。F：基于LC-MS/MS的绝对定量方法，奥曲肽在胃部的时间浓度曲线。Scale bar: 50 μm。

　　4.6奥曲肽在小鼠小肠部位的空间动态分布及其清除过程

图 7. 小鼠灌胃后20 min (A) 40 min (B) 60 min (C) 120 min (D) 240 min (E) 和360 min (F)。其中A1-F1：小鼠小肠切片的光学图像。A2-F2：奥曲肽(m/z 1019.44)离子密度图。A3-F3: 兰瑞肽(m/z 1096.47)离子密度图。G：基于LC-MS/MS的绝对定量方法，奥曲肽在小肠中的时间浓度曲线。Scale bar: 200 μm。

　　5. 结 论

　　通过iMScope TRIO前端搭载的高分辨光学显微镜拍摄的光学图像和相应的质谱图像的重叠，我们可以清晰地观察到奥曲肽从胃粘膜层到肌肉层的动态转移过程。同时，通过奥曲肽在小鼠胃肠切片上的相对量，计算出来的小鼠胃部以及小肠的吸收峰值Tmax分别为10 min和40 min，半衰期t1/2分别为28.0 min和37.7 min。更重要的是基于iMScope TRIO的定量方法，通过LC-MS/MS绝对定量方法的得到了进一步验证，确立了基于iMScope TRIO 的定量方法在药代动力学研究方面的可靠性和实用性。

　　6. 参考文献

　　[1] Tai Rao et.al. Pharmacokinetic study based on a matrix-assisted laser desorption/ionization quadrupole ion trap time-of-flight imaging mass microscope combined with a novel relative exposure approach: A case of octreotide in mouse target tissues. Analytica Chimica Acta. 2017.