刺破“假阴性”阴云！武汉大学开发纳米孔靶向测序检测方法

　　目前新冠病毒诊断主要采用的是qPCR核酸检测，但是该方法显示出较高的假阴性率和低敏感性，阳性检出率仅为30%至50%，从而导致临床高度疑似新冠感染患者或低病毒潜伏的“假痊愈患者”检测“假阴性”现象频发。此外，qPCR核酸检测无法同时检测其他秋冬季高发、症状与新冠病毒相似的其他呼吸道病毒，给疫情防控和患者分流管理带来极大挑战。

　　近期，武汉大学药学院刘天罡教授，武汉大学人民医院李艳教授、余锂镭教授，武汉臻熙医学检验实验室有限公司总负责人付爱思博士等迅速组建联合团队，创新性开发了纳米孔靶向测序(Nanopore Targeted Sequencing， NTS)检测方法。NTS结合了病毒靶向扩增和纳米孔测序长读长、实时数据输出的优势，首次实现测序后4小时内高敏感性、高准确性同时检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)和其他10大类、40种呼吸道病毒，其最低检测限高于目前广泛使用的qPCR的100倍。同时，该方法还可实现对新型冠状病毒基因组变异情况进行检测，监控病毒变异引起的毒性与传播能力改变的情况。

　　传统qPCR方法仅针对病毒基因组上2-3个位点进行检测分析，覆盖的病毒基因组<0.5%，样本在采样、存储、检测过程发生中稍有偏差，会导致仅针对少数基因位点的PCR检测手段的效率降低，甚至漏检，造成“假阴性”，且检测区域一旦发生变异，会造成检测结果失效。而NTS技术不局限于中国或美国疾病控制中心(CDC)目前在qPCR方法中推荐的位点，而是将检测范围扩大到9个基因、12个位点，近10 kb区域，全面覆盖病毒基因组上主要基因区域，100%覆盖病毒基因组上毒力相关的重要基因，检测病毒基因组范围提升100倍，从而显著提高检测敏感性和准确性。

　　通过平行测试NTS和qPCR两种方法，临床结果表明：45个临床高度疑似新冠感染患者的样品，NTS共鉴定出34个阳性样品，比qPCR多出15个;16个临床已确诊新冠感染患者中，NTS全部检测阳性，qPCR仅9个阳性。临床确诊样本显示，NTS比qPCR的阳性检出率提升43.8%。此外，对于高浓度病毒样本，NTS仅需测序10分钟即可检测阳性，即使极低浓度病毒样本，也仅需测序4小时完成检测，从收到样本到出具结果，全程控制在6-10小时而且该技术所需的纳米孔测序平台对实验室要求不高，其中最小测序仪MinION是便携式的，因此NTS也适合不同级别的医院使用。

NTS检测 图自科技日报

　　刘天罡说，qPCR方法好比是用一把狙击枪去击打样本中的病毒核酸，有一定概率击不中，而NTS技术不是用狙击枪，而是撒网，同时撒十几张网，这样能捕获病毒核酸的概率大大增加，不仅如此，还能在捕获的同时读出序列。这样，一次检测不仅可以确诊是否新冠，而且其他常见的呼吸道病毒，包括博卡病毒、鼻病毒、人间质肺病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、腺病毒、副流感病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒等，也能同时检测出来，能为医生分诊提供确切依据。更重要的是，还能检测在病毒传播期间与毒力相关的基因是否发生了突变，从而迅速为后续的流行病学分析提供信息。