Science封面| 冷冻超分辨与FIB-SEM结合新技术：三维蛋白超微结构可视化

　　仪器信息网讯 2020年1月16日，《Science》杂志刊登了美国科学家David Hoffman和Gleb Shtengel在Hess和加州大学伯克利分校高级研究员Eric Betzig的指导下的一项关于融合超分辨率荧光和电子显微镜技术的显微表征新技术成果，该技术称为cryo-SR / EM，结合使用超低温超高分辨率荧光显微镜和聚焦离子束铣削扫描电子显微镜，可以在整个细胞的三个维度上可视化蛋白质-超结构关系。凭借其重要性，该研究也荣登本期《科学》杂志封面。

Eric Betzig同时也是该文章的通讯作者，Eric Betzig何许人也？他正是2014 年诺贝尔化学奖得主，获奖理由是实现了单分子水平的超高分辨率荧光显微技术。

　　封面为哺乳动物小脑颗粒神经元的半透明彩色核，这张3D效果图展示了由电子显微镜(EM)和低温超分辨率荧光显微镜所成像的组蛋白重叠所定义的特异性异染色质亚区类型。围绕细胞核的半透明薄壳代表核膜，而3D渲染的电镜数据(灰色)薄片则穿过细胞核。右下角的圆圈是线粒体的剖视图。

　　一种新的显微镜技术将电子显微镜和光学显微镜相结合，以生成细致的三维细胞图像，如图所示。图片来源：D. Hoffman et al./Science 2020

　　有触须的的囊泡在很小的空间内穿梭负责将“货物”进行分类，相邻的神经元通过类似网络的界面相互依附。随着干细胞分化成神经元，DNA在核内重新排列。而一项新的显微镜技术可以将所有这些细节展现得淋漓尽致。

　　这项技术被称为cryo-SR/EM，它将电子显微镜和超分辨率光学显微镜捕捉到的图像融合在一起，以3D的形式呈现出细胞内部明亮、清晰、详细的图像。

　　技术背景

　　多年来，科学家一直在探索细胞内部的微观世界，开发新的工具来观察这些基本的生命单位。但是每种工具都需要综合权衡。光学显微镜可以通过荧光分子标记特定细胞结构能够轻松识别，随着超分辨(SR)荧光显微镜的发展，可以更加清晰的观察这些结构。但是，在一个给定的时间内，荧光只能揭示细胞中10000多种蛋白质中的一小部分，因此很难理解这几种蛋白质与其他物质之间的关系。另一方面，电子显微镜(EM)可以在高分辨率的图片中显示出所有的细胞结构——但是仅仅通过EM来描述一个特征与其他特征是很困难的，因为细胞内部的空间是如此的拥挤。

　　霍华德·休斯医学研究所珍妮莉亚研究园区的高级负责人Harald Hess说，“将这两种技术结合在一起，可以使科学家清楚地了解特定细胞特征如何与其周围环境相关联，这是一种非常强大的方法。”

　　Janelia科学家David Hoffman和高级科学家Gleb Shtengel在Hess和加利福尼亚大学伯克利分校HHMI研究人员Eric Betzig的高级研究员Eric Betzig的带领下率先开展了该项目。

　　首先，科学家在高压下冷冻细胞。这样可以迅速停止细胞的活动，防止冰晶的形成，而冰晶会破坏细胞并破坏成像的结构。接下来，研究人员将样品置于低温室中，在绝对零度以上10度的温度下，用超分辨率荧光显微镜对样品进行三维成像。然后，它们被移除，嵌入树脂中，并在Hess实验室开发的强大电子显微镜中成像，该显微镜向细胞表面发射一束离子，一点一点地研磨，同时为每一层新暴露的细胞拍照。然后，计算机程序将这些图像拼接成三维重构的图像。

　　最后，研究人员叠加了两个显微镜的三维图像数据。结果：令人震惊的图像以惊人的清晰度揭示了细胞的内部细节。

　　下面，此图像的一些示例说明了科学家如何使用该技术。 “已经引起了很多兴趣，” Hess说， “还有很多实验要做——整个世界的细胞都需要研究。”

　　全细胞相关成像。高压冷冻细胞的低温超高分辨率荧光显微镜与聚焦离子束扫描电子显微镜(FIB-SEM)结合使用，可以在全局超微结构背景下对蛋白质进行多色三维纳米可视化。 从左上方顺时针方向：体积渲染的细胞，具有线粒体和内质网(ER)蛋白相关的正交排列(插图); 形态各异的溶酶体区室;由转录活性的蛋白质报道分子定义的异染色质亚结构域;与小脑接触处膜粗糙度相关的粘附蛋白颗粒神经元;过氧化物酶体(粉红色)与ER薄片(红色)和线粒体(青色)并置。

　　在细胞开始(成年)之前(左)和之后(右)，神经元的细胞核看起来截然不同。随着细胞的成熟，DNA被重新包装在细胞核内以开启新的一组基因。这些变化反映在两个细胞内部的灰色斑点和彩色荧光的不同模式中。 “这项技术为分化前后的细胞核状态提供了惊人的详细快照，”参与该项目的圣犹达儿童研究医院的David Solecki表示。图片来源：D. Hoffman et al./Science 2020

　　发育中的神经元粘在一起。这段视频准确地展示了这些细胞是如何相互粘附的，揭示了类似瑞士奶酪一样的联系，帮助年轻的神经元正确地迁移到它们在神经系统中的最终目的地。黏附蛋白的紫色和绿色超分辨荧光图像与电子显微镜下详细显示膜结构的图像相互关联。资料来源: D. Hoffman et al./Science 2020

　　细胞内充满了小囊泡——这是一种膜囊，帮助细胞储存蛋白质、分解细胞垃圾和运输货物。仅在电子显微镜下，这些不同种类的囊泡是无法区分的。但通过cryo-SR / EM，它们的明显特征变得清晰起来。这段视频放大了核内体，核内体负责将货物运送到细胞内的不同区域。资料来源: D. Hoffman et al./Science 2020