测序技术简史(二)| 爆发式的进步

　　前面，我们谈到了测序技术经历发展的前两个阶段。双螺旋的发现，让测序成为可能，历经了从“前直读”到“直读”，从手工到自动化的飞跃。本期，我们将带您了解测序技术发展的另外两个阶段，回顾测序技术如何因原理的改变迎来爆发式的突破与增长。

　　阶段3：从“平板”到“毛细管”

　　的确，平板凝胶电泳技术在历史上的功绩是十分卓著的。然而，受限于技术原理，在“人类基因组计划”后期已经没有更多的发展改进空间，正如今天的晶体管小型化技术也有无法逾越的物理学限制。

　　就在此时，毛细管电泳技术横空出世。在测序领域，毛细管电泳测序法替代平板电泳测序法是一场真正意义的技术革命，可与汽车替代马车相提并论。直接效果是显而易见的：原本工作进度严重落后的人类基因组计划再度发力，以极快的速度和较高的质量提前两年宣告完成。

　　毛细管电泳测序仪实现了SBS直读式测序技术的规模化、高通量化和全自动化(不再需要人工制胶)。但正如汽车刚出现时，在速度、装载量、灵活性等各方面与马车表现出的差距，ABI公司在上世纪90年代推出第一代自动毛细管测序仪ABI 310时，不但通量没有明显提高，精度低，更在评价测序仪的关键指标“读长”方面，与成熟的平板电泳测序仪有较大差距。因此，尽管有部分人认可毛细管电泳技术的应用前景，但当时似乎看不到在短时间内大幅改进的希望，因此并不被普遍看好。不过，正如许多新生事物一样，尽管毛细管电泳技术在初期有着各种明显缺陷和严重问题，却代表了未来相当长时间内测序仪开发的正确技术方向。

　　1998年，ABI公司推出ABI3700毛细管电泳测序仪，在读长和准确率等指标上追平了成熟的平板电泳测序仪。最重要的是，它的测序通量提高了数倍，并且克服了平板电泳无法依赖大量手工程序的缺陷，实现了从上样、数据收集到质检、初步分析的全面自动化。从此，一个人可以同时管理十几台运转中的测序仪，只需定时更换DNA模板和毛细管即可。

ABI3700

　　作为生命科学研究的核心工具，基因测序仪价格极为昂贵且发展日新月异。因此，对于测序仪技术方向的选择直接决定了一个现代基因组研究中心未来的命运。

　　20年前，财力雄厚的日本开始大力投入资金，进行测序中心建设。他们选择了当时在读长、精确度等关键参数远超毛细管测序仪的平板测序仪。更具吸引力的是，平板测序仪使用人工灌胶，运行成本还很低，因此选择平板测序仪似乎顺理成章。当时，中国在基因组学方面的研究刚刚起步，经济上十分拮据，但却选择了读长及精确度都较低、价格极为昂贵，但通量提升方面具有很大潜力的毛细管测序仪，并将有限的经费全部投入。中国测序中心领导者的思路是以“大规模效应”省钱，以“高通量”赢得时间，这个策略后来被历史证明极为正确。日本研究中心大量的平板测序仪则很快被淘汰，连机器用的试剂都无法得到持续供应，从此一蹶不振。

　　阶段4：从初步规模化到大规模并行高通量测序

　　毛细管电泳测序仪实现了DNA测序的高通量和自动化，标志着研究生命体完整基因的基因组时代的到来，为人类基因组计划做出了历史性的贡献。然而，到2003年，毛细管电泳测序技术却差不多走到了极限。

　　如果说平板电泳测序技术的最大问题是无法实现自动化和规模化，那么毛细管电泳测序技术在实现这两点的基础上也存在重大的缺陷。不可避免地，这种技术要遵循“一个样本、一个反应、一条泳道”的规则，每个样本的文库和模板都要单独制备，过程费时费力、成本高、错误率高、成功率低。如果这些步骤实现自动化，那么为节约昂贵的反应试剂，又需要逐个模板进行质控检查，严重阻碍了效率提升。

毛细管电泳法测序工具

　　毛细管电泳测序仪的局限还在于：若想进一步提高通量，只能在物理上把毛细管做的更细、并增加毛细管泳道的数量，原理与在芯片上集成晶体管类似。2003年，有测序仪生产公司做过这方面的尝试，将主流毛细管测序仪的毛细管泳道从96道提高到384道，但这个尝试未能如愿。毛细管电泳测序仪走到了末代的平板电泳测序仪依靠物理方法提高测序通量的阶段，证明这种技术已经没有再提升的空间了。

　　不可否认，毛细管电泳测序技术将一个人的全基因组测序成本从平板电泳时代的数十亿美元降低到3000万美元，实现了技术上的重大飞跃，但这个测序成本仍然十分昂贵，远不能满足基因组学发展的需要。时代呼唤新的测序技术。在这个背景下，大规模并行高通量测序技术(MPH：Massively Parallel High-throughput)问世，是测序技术发展史上影响极为深远的一场革命，因此也被称为下一代测序技术(NGS：Next-Generation Sequencing)。

　　2005年12月，第一台代表大规模并行高通量测序技术的测序仪454 GS20，由美国Life Science公司开发成功，性能十分优异。2006年，Life公司宣布使用454测序仪为DNA双螺旋结构的发现者詹姆斯·沃森完成了全基因组测序，费用约为200万美元。454采用了基于SBS法基本原理的焦磷酸测序技术，这种新型的酶联级联测序技术，适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与Sanger DNA测序法相媲美，而速度却大大的提高。通过检测反应中的焦磷酸信号判断DNA序列，并不直接读取DNA中的碱基。运用类似原理的还有使用半导体原件检测测序反应中氢离子浓度的半导体测序技术。

Life Science 454

　　大规模并行高通量测序技术(MPH)实现原理有多种，但都有两个共同特点：

　　一是“裸、密”并行，摒弃了“一个模板、一个泳道”，以芯片实现了大规模、多模板并行测序。一张芯片可以集成数亿个模板的高密度分子簇(cluster)，每一个分子簇为一个裸露的测序反应，测序通量提升了几个数量级。从样本制备的角度看，更是一场革命：以往毛细管电泳时代“一个样本、万个克隆、万个制备、万个质控”的样本制备形式一去不复返。

　　二是测序通量的提高以牺牲“读长”为代价。相比成熟毛细管电泳测序仪600nt的读长，大规模并行高通量测序仪刚问世时读长仅为100nt，读长短板主要靠生物信息软件算法来弥补，对生物信息处理能力提出了更高的要求。

　　在大规模并行高通量测序技术中，最早实用化的焦磷酸测序和半导体测序都是基于SBS法(Sanger法)，此后出现了对SBS法进行革命性改进的新一代SBS法，其中最具代表性的是美国Illumina公司的循环SBS法(cycle SBS，也称为可逆终止法SBRT：Sequencing By Reversible Termination)和华大智造(MGI)的环化单链DNA+DNA纳米球测序法(cssDNA+DNB：circle single-strand DNA+DNA Nano-Ball),是当前最先进的实用化大规模并行高通量测序技术。

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