我国学者解析DNA复制起点识别复合物高分辨冷冻电镜结构

    图  ORC通过弯曲DNA来进一步加载DNA复制解旋酶MCM2-7的过程模式图

    在国家自然科学基金项目(项目批准号：31761163004、31725007、31630087)等资助下，北京大学生命科学学院高宁教授课题组与香港科技大学戴碧瓘教授课题组合作，解析了酿酒酵母ORC结合DNA复制起始位点3-Å分辨率的冷冻电镜结构。研究成果以 “Structure of the Origin Recognition Complex Bound to DNA Replication Origin”(结合有复制起点DNA的起点识别复合物结构)为题，于2018年7月4日以长文(Article)形式在Nature(《自然》)上发表。北京大学高宁教授和香港科技大学戴碧瓘教授、翟元樑博士为共同通讯作者。高宁课题组博士后李宁宁、博士生程稼萱以及戴碧瓘组博士后林伟熙、翟元樑为共同第一作者。

    DNA复制起始在真核生物细胞中受到严格而精密的调控。DNA复制启动因子(ORC，Origin Recognition Complex)首先结合到DNA复制起点，以加载DNA复制解旋酶MCM2-7复合物到DNA上，随后MCM2-7被激活，DNA双链被解螺旋，从而启动DNA复制。所有真核生物都是利用由6个亚基组成的ORC来标记DNA复制起始的位点，在维持基因组稳定性过程中的重要作用，其功能缺失突变与肿瘤的发生发展也密切相关。

    虽然在不同的真核生物中，ORC的蛋白质序列高度保守，但是ORC对DNA复制起点序列的选择性在不同物种间差别很大。酿酒酵母的ORC可以识别特异的DNA复制起点，而人源细胞ORC结合的DNA序列却没有序列特异性，主要依赖染色体结构识别复制起点。而由于一直缺少ORC结合DNA状态的高分辨结构，ORC序列识别差异背后的分子机制长期以来难以解释。

    高宁研究员课题组解析的3-Å分辨率ORC-ARS305 DNA复合物结构发现，ARS305包含一段ARS高度保守序列(ARS Consensus Sequence, ACS)和一段B1元件序列，长度为72 bp。在这个结构中，ORC的六个亚基通过与磷酸骨架的非特异性以及与碱基的特异性相互作用环绕DNA，并在ACS和B1位点使DNA发生弯曲。该结构的一个关键特征是Orc1的保守碱性氨基酸区域(Orc1-BP，basic patch)深深地插入ACS的小沟中进行序列特异的碱基识别。另外，酵母特有的具有物种特异性的位于Orc4 Wing Helix结构域(WHD)中的Helix Insertion(Orc4-IH)嵌入ACS的大沟中，与相应的碱基形成疏水相互作用。更重要的是，在ACS区域形成的这些碱基特异的相互作用的碱基都非常保守。此外，在B1区域中，也有类似的来自Orc2和Orc5的碱性氨基酸区域插入到大沟和小沟中，与碱基相互作用，并使DNA弯曲。因此，酿酒酵母ORC高度序列特异性主要是通过ORC亚基的大沟、小沟插入基序与ACS保守碱基之间的特异性相互作用实现的。序列比对分析显示，所有真核生物Orc1的N端都具有类似酿酒酵母的Orc1-BP;然而Orc4-IH却只在酿酒酵母中存在。这些发现，很大程度上解释了不同物种ORC识别起始DNA特异性差异背后的原因。

    此高分辨率结构不仅为理解酵母ORC如何识别和结合序列特异性的DNA复制起点提供了分子基础，同时也从分子机制角度阐明了ORC如何通过弯曲DNA来进一步加载DNA复制解旋酶MCM2-7的过程。