安捷伦液相色谱与EYELA前处理仪器助力新国标食品中维生素A、D、E的测定

　　维生素是生物生长和代谢所必需的微量有机物。分为脂溶性维生素和水溶性维生素两类。前者包括维生素A、维生素D、维生素E等，后者有B族维生素和维生素C。人和动物缺乏维生素时不能正常生长，并发生特异性病变，即所谓维生素缺乏症。目前随着国家对食品安全的重视，及国家GB5009. 82 — 2016新国标的执行，《食品安全国家标准 食品中维生素 A 、 D 、 E 的测定》，HPLC 法作为国标第一法测试维生素A,E及第四法测定维生素D的方法。此处，安捷伦液相色谱仪及EYELA前处理仪器则为新国标的实施诠释了完美的解决方案。

　　1、维生素A、D、E的测定原理：

　　食品或保健食品试样经过皂化后，经石油醚萃取，用液相色谱法分离，外标法定量。

检测试样举例：市售奶粉、奶粉伴侣、米粉、婴幼儿葡萄糖和复合维生素片维生素AD制剂或鱼肝油等样品。

　　2、试剂与材料

    MILLIPORE MILLI-Q 一级超纯水

    无水硫酸钠：化学纯

    乙醇：色谱纯

    氢氧化钾：化学纯

    石油醚：沸程30 ℃～60 ℃，化学纯

    甲醇：色谱纯

    0.22um有机系针筒式微孔滤膜过滤器

    维生素A,D,E 标准品，美国 SIGMA 公司

　　3、仪器和设备

    AGILENT 1220II-DAD梯度高效液相色谱仪

    旋转蒸发器EYELA N-1300V-WB

    恒温震荡空气浴摇床：EYELA NTS-4000BH(控温：》60度）

    氮吹仪EYELA MGS-2200

    超声波清洗器PM5-2000TD

    天平：感量为 0.1 mgMETTLER MS-204TS

    HAIER 低温冰箱 DW-25L278(-20度）（保存标准品储备液）

    聚四氟乙烯漏斗

    500ml分析漏斗

    快速滤纸

    分液漏斗木头架

    分液漏斗振摇器EYELA MMV-1000W

　　4、分析检测方法步骤

    1. 皂化：

    1）准确称取样品：5-20g到250m皂化瓶中；

    2）加入40ml 含16g/l抗坏血酸的无水乙醇溶液，搅拌均匀后，加入氢氧化钾（KOH:H2O=1:1）25ml。

    3）确保在EYELA NTS-4000BH 水浴振荡箱 60℃下皂化60min 摇匀，避光 ;使皂化完全，皂化后立即置于冰水浴冷却；

    2.提取

    1）皂化液转入500ml分液漏斗，用150ml石油醚提取于EYELA MMV-1000W分液漏斗振摇器振摇5min，静止5min分层。

    2）分层后转移至另一个分液漏斗，加100ml石油醚同法萃取，合并醚液，

    3）水洗有机相3次至中性

    醚液过无水硫酸钠，用250ml鸡心瓶收集。

    4）40℃EYELA N1300V-WB旋蒸蒸发旋蒸至1ml左右

    5) 用约5ml石油醚洗待测组分于50ml塑料离心管，EYELA MGS-2200氮吹仪吹干。

    6) 用10ml色谱甲醇复溶解，涡旋混合仪混匀。

    7) 样品过0.22μm滤膜，进样10ul上Agilent 1220HPLC.

    5F维生素A、D、E 测定色谱

    色谱柱：Agilent色谱柱：Prooshell 120 PFP(五氟苯基）， 50 mm ×4.6 mm, 2.7μm，（备注：PFP柱对位置异构体具有良好的选择性的保留时间）

    检测波长：维生素A(325nm)；维生素:(294nm)；维生素D:264nm。

    波长检测方法：（0-4.5）min 325nm，（4.5-6）min 改变为294nm，5min左右切阀（时间长短0.4-0.45min）（6-15）min改变为264nm.

    柱温：35 ℃±2℃。

    进样量：10 μL。

    时间：15min

    流动相：一维:甲醇,水；流速：:1ml/min；

    维生素A D E 标准曲线的绘制

　　标准曲线的制作

　　本法采用外标法定量。将维生素A 和维生素 E 标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中,测定相应的峰面积,以峰面积为纵坐标,以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线,计算直线回归方程。