LC故障排查-USP方法调整

　　若要针对一个不同尺寸的柱调整一种美国药典(USP)方法或满足未能满足的系统适应性标准，在没有重新确认方法的情况下可进行何种程度的修改?

　　一位同事最近要我为“LC故障排查”写一篇最新报道，论述美国药典公约现行方法液相色谱法(LC)专业人员谈话时，这都是一个关于研究范围的热门话题。当前所讨论的指导准则源自美国药典第621章(由美国药典[USP]进行简化，此处为<621>)(1)。美国药典至少每两年更新一次，因此最好查阅最新版本查看是否有任何变化。我在此处使用的是2017年5月1日生效的“美国药典40-国家处方集35”(USP 40-NF 35)(1)。

　　首先我要指出一种我经常遇到的错误观念。由于USP<621>已经成为色谱法调整规则的事实标准，许多使用者认为这意味着所有方法。事实上，<621>仅适用于美国药典中公布的专著所述方法。这意味着其不适用于实验室中开发和验证的方法、科学文献中获取的方法或从其他来源得到的方法。综上所述，大多数指导准则都可作为其他许多类型的方法的调整依据。例如，您可以将其用作自有实验室方法调整标准操作规程(SOP)的依据，但在此种情况下，它们只是您自己的指导准则，而非美国药典公约指导准则。最后，当前论述中的指导准则解释完全基于我自己的观点，而非美国药典公约或他方的官方意见。

　　系统适用性

　　良好的系统适用性测试是任何液相色谱法可靠运行的关键。此项测试有助于验证整套方法的效果是否好到足以产生精度和准确度均满足要求的分析结果。系统适用性测试通常要对保留时间、柱效率、分辨率、峰拖尾、检测器响应值、精确度和准确度等特征进行一定程度的评估。因此，美国药典对系统适用性的密切关注也就不足为奇(1)：

　　指定色谱系统可能需要进行调整，以满足系统适用性要求。为满足系统适用性要求而对色谱系统进行的调整不是为了弥补柱故障或系统运行失常。只有当调整或换柱所得色谱符合官方程序规定的所有系统适用性要求时，调整才能得到认可。

　　我对这句话的理解是：若调整未超出推荐范围，且经调整后通过了系统适用性测试，则调整将获得认可。若要继续使用该方法，我只需对调整进行文件记录(并满足我公司所有内部要求)，无需进行重新验证。若超出调整限值，调整将被视作方法修改或更高，因此需要进行一定水平的重新验证。

　　接下来让我们探讨一下USP<621>所列各种调整情形。部分调整可适用于等度或梯度方法，而其他调整则不具普适性。我将各种调整情形总结于表1中。表1最好连同下列论述一同解读，因为下列论述考虑了调整的细微差别。我对此无法找出具体陈述，但表1所列各种变化适用于反相分离，因此我假设这就是意图。

　　pH

　　如表1所示，流动相缓冲液pH容许调整范围为±0.2单位。乍一看，这就像是一个合理容限。但实际上，大多数实验室在使用pH计时都会考虑±0.05-0.1pH单位的标准实验室变化。因此应将标准变化量乘以二。例如，标称pH为2.5的方法可在“2.3≤pH≤2.7”范围内进行调整。应用这些指导准则时必须特别仔细-我收集的一副色谱中一个分辨率较高的峰对退化成了pH变化仅为0.1单位的两个几乎没有任何区别的凸起。其他有关pH调整的注意事项参见最新出版的“LC故障排查”pH部分(2)。

　　缓冲液浓度

　　USP指导允许缓冲液浓度存在±10%的变化幅度。我对此没有异议，但我怀疑您可能无法观察到反相法中如此微小的变化，除非该方法此时缓冲液不足或者位于饱和点附近。回想上月刊(3)表1相关正交影响的论述，缓冲液浓度的双倍变化在反相条件下不会改变选择性。我认为缓冲液浓度为25mM的方法在色谱不发生明显变化的情况下无法在10-50mM范围内进行调整。就反相液相色谱而言，±10%的限值范围对我没有任何意义。尽管如此，离子相互作用较为重要时(例如离子交换色谱法或亲水作用色谱法(HILIC))，缓冲液浓度能够发挥重要作;因此，我们不能说缓冲液浓度永远不会改变色谱分离。

　　流动相的组成

　　表1所列流动相组成相关说明似乎有些令人困惑：流动相微量组分±30%相对变化，但不超过±10%。几个实例便可将其解释清楚。首先考虑50:50A-B的流动相，其中“A”表示液体部分(缓冲液或水)，“B”表示有机物(通常为乙腈或甲醇)-50%的30%是15%，由于15%大于10%，溶剂浓度辩护不能超过10%。因此，我们可以从40:60 A-B转变为60:40 A-B。这是一项简单的计算，但变化对我而言有些极端-您什么时候见过流动相乙腈变化达±10%时仍能正常运行?要谨记最近关于保留的论述中所提出的“三倍法则”(4)，流动相有机部分变化10%可使保留系数(或良好保留峰的保留时间)变化三倍左右。因此，在使用美国药典流动相调整指导准则时务必小心仔细。

　　A和B的浓度存在显著差异会出现何种情况(例如：5%的缓冲液和95%的已经)?此种情况下，缓冲液浓度的30%等于1.5%，远低于±10%的限值。此时的容许范围为3.5:96.5~6.5:93.5 A-B;看起来是一个合理的容许范围。

　　三元流动相的计算稍微复杂一些：例如，有35：5:60 A-B-C组成的流动相，其中C是指第二种有机溶剂。该例中，30%的30%等于10.5%，因此A的变化限值为10%。我们可使用上文针对B计算得出的1.5%调整率。容许调整可以是A的35±10%与B的5±1.5%以及C剩余部分的任意组合。您会发现这里允许存在相当明显的变化-再次提醒大家注意这些变化。

　　紫外检测器波长

　　检测器波长指导准则有点儿领人费解。检测器波长不容改变，但如果第二个检测器超出校准值3mm以内，则可投入使用。那么，如果我不想使用当前的波长，我会使用一个无法正常运行的检测器吗?当然不会!调整说明就像来自检测器标定还是一种常见问题的时代的“古董”。如今使用的大部分紫外(UV)检测器在启动后都可自动校准检查，并在过程中进行自校准。我已经20年没有见到过紫外探测器校准问题了，估计只有掉落或其他误用情形才会导致检测器出现校准问题。

　　柱长和颗粒尺寸

　　经允许的柱相关修改是美国药典做出最大改变以改善应用灵活性的领域之一。直到2012年(USP 35-NF 30)，允许发生的变化还十分有限。例如，柱长L可改变+70%，这看起来幅度相当大。您可以将150mm柱换成250mm柱(250/150=±67%)或将柱长从150mm调整为100mm(-33%)或50mm(-67%)，似乎都不会有什么问题。您还可以将颗粒尺寸dp减小50%，但不能增加。因此，5_μm(-40%)，但不要改的过小。上述推荐做法存在一个明显缺陷，就是：其忽略了柱长和颗粒尺寸对色谱柱塔板数以及分辨率的影响。此外，这些推荐做法无法将5_μm颗粒柱调整为≤2_μm颗粒的超高压LC(UHPLC)柱，或将UHPLC方法调整为更强大的日常作业用5_μm颗粒。因此，尽管这些容限已使用多年并可实现极具实用性的变化(例如：从旧式250mm 105_μm柱转换为目前广泛使用的更标准的150mm 5_μm柱)，但它们并不适合如今的实验室环境。

　　但现在有一种更加灵活的容限，其采用更加严密的科学依据，核心内容是确保色谱柱塔板数和相应的分辨率具备相当高的稳定性。由于板数是柱长度与粒径之商的函数，L/dp比在这里是一项关键因素。只要L/dp保持恒定，便可改变柱长和粒径;该结果中的容许变化范围为-25%~+50%，其具有一定的意义，用为市售产品的离散柱长和粒径数量有限。

　　表2内容摘自美国药典现行版本(1)，包含部分可实现更改的实例。美国药典许多专著方法已相当落后，规定的柱规格为250mm×4.6mm，10-μmdp(L/dp=25000)。您可以将该方法轻松升级为150mm×4.6mm，5_μmdp(L/dp=30000);如此一来，L/dp可增加20%，未超出限值范围。若倾向于使用较小的颗粒，则可使用100mm×4.6mm，3_μmdp(L/dp=33000);注意，我在这里为方便陈述而对数值进行了四舍五入。您甚至可以使用UHPLC以及装满1.7_μm颗粒的50mm管柱(L/dp=29400)，且仍不超出限值范围。上述所有管柱均提供大致相同的板数，因此可实现相同的分离效果。此种情况的假设条件是所有管柱都具备相同的化学性质(具有相同的键合相;来自相同制造商;采用相同包装品牌)。然而，我们不需要过于担心化学变化，因为：若要满足要求，方法还须通过系统适用性测试，任何无法接受的化学变化都会导致系统适用性试验失败。

　　若使用相同类型颗粒(最常见的颗粒类型是完全多孔颗粒TPP)，L/dp方法效果极佳。尽管如此，从TPP转换为应用日益广泛的表面多孔颗粒(SPP)时，此项技术会出现分化。SPP所提供的板数通常对应尺寸更小的颗粒，因此，采用L/dp方法时粒径可能会产生误导。例如，2.7_μm dp SPP柱具有~3_μm dp SPP柱的背压，但板数却更接近~1.8_μm dp SPP柱。因此，上例中50mm，2.7_μm SPP柱的L/dp=18500：若从250mm，10_μm柱攥起，则剧减26%，但与150mm，5_μm柱相比降低近40%。根据L/dp结果放弃SPP柱并无科学意义;相反，在存在一种可选容限，规定板数N应在相同的-25℃~+50℃范围内保持恒定。此种情况下，SPP柱将是一种可接受的替代技术(假设已经通过系统适用性测试)。

　　柱径和流量

　　只要流量F调整时确保流动相线速度保持恒定，柱径dc便可更改。理论上讲，最大柱效对应线速度随着粒径的改变出现反向增加。针对粒径而调整线速度时最好参照降低的速度。我们当中大多数人都不会担心这种额外的调整，但其包含于方程1(1)中，使所需调整简单明了。除基于方程1而允许进行的更改之外，流量最大调整幅度为±50%。

　　其中，下标标识原柱1和新柱2的变量。

　　表2所列实例描述了250mm×4.6mm，10_μm柱以150mm柱一半的流量运行。假设初始流量为1.0mL/min，我们会将流量减小至0.5mL/min，以获得相同的较低速度。尽管如此，较低流量与较大柱长的组合会导致运行时间过长;因此，我们大多数人都会保持1mL/min的流量(容许附加调整范围为±50%)，以实现更短的运行时间和合理的压力。表2还列示了新柱相对于原柱的压力和运行时间的估算值。

　　美国药典论述对粒径变化进行了附加详细说明：若板数减少量不超过20%，则传统LC条件(≥3_μm dp)转变为UHPLC(<3_μm dp)(反之亦然)时允许对流量作进一步调整。只要通过系统适用性测试，此种方法可实现一定的灵活性(可能会受到其他限制)。

　　最后要注意的是，柱尺寸、粒径和流量调整仅适用于梯度方法。虽然可针对此类变化适当调整梯度方法，它们并未含入现行版美国药典;因此，在决定调整梯度方法时必须进行一定的再验证。

　　进样量和柱温

　　只要作用方法正常运行，进样量便可增加或减少。若要大幅增加进样量，一定要注意谱带增宽过度和保留时间变化的情况。减少进样量时一定要确保有足够的信号提供可接受的精确度和准确度。高于和低于拟用新进样量进行的多次进样有助于验证(并记录)变化的鲁棒性和适用性。

　　柱温变化幅度为±10℃，但要记住，温度没变化1℃，等度保留时间就会缩短约2%。选择性随温度变化而改变，特别是样本中存在可电离化合物时。改变柱温时务必保证样本临界峰的分离不受影响。

　　结论

　　正如我们所见，美国药典为LC方法调整提供了合理的指导准则。这些容许范围适用于等度方法，但对于梯度方法，其可能会被禁止或不推荐使用，我会再次回到我最开始提出的问题。美国药典指导准则仅适用于美国药典所包含的专著方法的调整。我们认为指导准则不使用于非美国药典规定方法，因此在违反相应规范的情况下不允许更改其他方法。最后，许多公司对美国药典和其他规范性文件都有自己的解释;因此，在决定调整LC方法时必须查阅内部标准操作规程和其他规范性指导。切记：“调整和更改应以文件记录为依据”，因此必须适当保存相应记录。

【本文由LC/GC杂志供稿，作者：John W.Dolan，LC故障排查编辑】