随着生活水平的提高,人们的关注重心已经从温饱问题转移到更高的追求:精神水平的提升和个人生命的长度。增加人类寿命,势必要克服各种各样疾病的困扰。现代医学的研究重心在于尽早发现和精准治疗,表现为生命体中生物标记物(Biomarker)的浓度水平和治疗药物的代谢过程等研究。
目前,医院临床实验室中的特定诊断通常使用免疫检测和分子检测手段,交叉反应和干扰较为严重;作为替代手段,LC/MS基于色谱和质量选择性对化合物进行分离,灵敏度更高;可有效监控治疗药物,节省时间和成本。
影响LC/MS实验结果的因素较多,在保证系统运行基础上,如何保证高灵敏度的实验结果呢?可从以下两方面考虑:
1. 前处理
在LC/MS分析中,干扰物与分析物共流出,会影响液滴形成或引起共电离等问题,造成
分析物离子化水平不稳定。
磷脂类化合物是分析血液中生物样品时,造成离子抑制的一个主要原因:
磷脂类化合物结构
传统的血液前处理方法,包括蛋白沉淀、液液萃取和固相萃取存在或多或少的局限性,例如只能沉淀克级蛋白和与目标分析物共萃取等。
默克全新的固相萃取产品HybridSPE®-Phosphorlipid,基于物理和化学作用,可同时有效去除血液中的蛋白和磷脂,提高液质检测的灵敏度。
HybridSPE®产品
96孔板规格的HybridSPE进行“仿真沉淀”:
维生素D及相关代谢物的LC/MS实验
维生素D可以促进儿童骨骼增长,降低老年人骨质疏松等。维生素D缺陷,自发现以来,一直是研究重点。维生素D以两种形式存在:维生素D2和维生素D3 ,两者在肝脏中进行代谢。其中25-羟基类代谢产物浓度水平,可用于维生素D相关疾病的诊断依据。最近研究表明,将非活性的3-epi维生素代谢产物与其他代谢产物分离开,更有助于疾病研究。采用LC/MS对代谢产物浓度研究的关键,在于血液中相关蛋白的去除。
维生素D及相关代谢物的结构和分子量信息
维生素D及相关代谢物在色谱柱Ascentis Express F5(150 x 2.1 mm, 2.7 μm)上的分离
维生素D及相关代谢物经不同前处理方法得到的回收数据对比
基于Ascentis Express F5色谱柱的选择性,可建立一个快速有效的LC/MS方法,用于体内维生素D代谢物的研究。采用HybridSPE®,对血液样品进行处理,去除其中的磷脂和蛋白,可有效提高分析方法的重现性、稳定性和回收率。
2. 溶剂
溶剂等级不同,其所含有的杂质含量不同, LC-MS分析时会产生不同的基线背景和噪音,影响检测的灵敏度:
通过注射泵将两种不同级别的乙腈直接注射入MS系统
为保证高灵敏度的LC/MS分析,需采用高级别的溶剂,以利血平作为示例。
利血平测试
将利血平标准品通过注射泵注入MS系统,将所得的信号强度与背景噪音强度进行比较:
不同等级溶剂下得到的利血平LC/MS图谱
对利血平的分子离子峰的信噪比进行计算:
不同等级溶剂下得到的利血平分子离子峰信噪比值
利血平分子离子峰信噪比值结果表明,采用超梯度级的乙腈,所得到的信噪比值不仅高于梯度级乙腈得到的结果,而且明显高于其他两个品牌LC/MS溶剂测得的信噪比值。
结论:
为保证高灵敏度的LC/MS分析结果,可从两方面着手:
1. 采用HybridSPE®对样品中的磷脂和蛋白进行高效去除;
2. 采用超梯度级的乙腈,降低LC/MS分析中的背景值,提高分析峰信噪比。
[来源:默克化工技术(上海)有限公司] 未经授权不得转载
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