532、785还是1064nm?手持拉曼激发光选择有讲究!

　　拉曼光谱可以高灵敏度分析化学物质的结构和组成，具有非接触、非侵入性和无损性，无需样品制备(或者只需简单样品制备)等特点。随着仪器开发和分析方法等方面的突破，如荧光校正技术等，拉曼光谱得到越来越广泛的应用，包括医疗诊断、药物分析、假冒药品鉴定、爆炸物探测、文物检测等多个领域。

　　近年来，发展高效和易于使用的小型便携式或手持式拉曼系统是拉曼光谱一个很重要的发展方向。大多数这样的手持系统能够直接分析容器和包装袋中的样品，不需要任何样品制备，同时也避免了对化学物质的接触。

　　目前，市场上已经有来自于10多个生产厂家的20多款商品化的手持式拉曼分析仪。

　　研究目的

　　那么，选择一款适合的手持拉曼光谱仪需要考虑哪些关键因素?本文的一个重要目的就是给出半理论、半经验的注意事项，帮助用户选择一款最适合其应用的手持式拉曼光谱仪，表1和图1对性能比较进行了汇总：

图1: 532nm、785 nm、1064 nm手持式拉曼仪性能对比(单位激光功率)：(a)光学透过率(b)纯分析物 (c)分析物在水中 (d)分析物在乙醇中。

　　手持拉曼的激发波长很大程度上决定了拉曼信号的强度(分析速度和精度)。此外，还会影响到光学元件的效率和相关检测器的量子效率 (CCD、InGaAs)以及光谱分辨率等。目前，大多数商品化的手持拉曼光谱仪采用785nm或1064 nm的激发。只有少数最近生产的手持式拉曼系统使用其他激发波长，包括532nm。

　　此外，本文还通过实验特别介绍了使用532 nm激光的手持式拉曼分析仪在假药检测以及爆炸物检测方面的性能表现(与785、1064 nm进行对比)。

　　532nm，785nm，1064nm，哪个更适合手持拉曼?

　　虽然多个商业化激光在技术上可以满足给定的应用，但对于一个特定的应用来说，通常只有一个可以提供最好的解决方案。所以选择最佳激发波长时要考虑多方面的因素:每个激发波长对应的分析速度和准确度、样品的荧光背景、样本基质的透明度(容器壁、溶剂、被测物)等等。

　　在分析速度和准确度方面，532nm激光得到的拉曼信号强度(单位激光强度)是785nm或者1064nm的5-16倍，这是因为拉曼强度与激发波长的四次方成反比：IRaman≈(1/λEx)⁴。此外,在532nm处，先进的光探测器和光学器件具有更高的量子效率(与785和1064 nm相比)，可以进一步提高拉曼信噪比。

　　相比之下，在降低荧光背景方面，1064nm是首选。然而，1064nm在分析速度方面比532nm、785 nm系统(单位激光功率)分别慢16倍和3倍。因此，1064nm激光适合具有非常强烈荧光的样品，其他情况下，785nm，特别是532 nm的激光可以提供更快的分析。

　　为了考察样品基质对拉曼信号的影响。图1a给出了几个典型样本的透射情况：透明玻璃 (实验室小瓶或一般瓶子)、琥珀玻璃(小瓶或一般瓶子)、透明塑料(培养皿、塑料瓶、证据袋或罩板包装)、仿琥珀塑料 (医疗处方瓶)、水和乙醇等。

　　根据图1a的数据，图1b-d给出了几种典型分析得到的相对拉曼强度 (归一化到532nm)：纯被分析物，以及处于一系列不同容器中的被分析物(图1b);分析物在水溶液中，以及处于不同容器中的情况(图1c);分析物在乙醇溶液中，以及处于不同容器中的情况(图1d)。图1表明532nm的拉曼信号强度比其他情况要高出25-1600%。

　　表1对图1中的数据进行了进一步的总结，通过比较发现，在9类不同条件的样品中，有7类使用532nm激发时的效果明显优于785和1064 nm，这其中包括不发荧光和弱荧光样品、一部分中等荧光样品;通过最常见的玻璃和塑料容器（包括琥珀）进行测量的样品;以及水溶液和大多数有机溶剂中分析物的检测和定量分析。

　　实验

　　所有样品分析均使用RamTest手持式拉曼 (BioTools,Inc .);激光：532 nm;光谱范围120-4000cm-1;光谱分辨率~4 cm-1。

　　所有测试都是在自动模式下运行，所有测量参数自动调整以优化信噪比，减少荧光，剩余的荧光背景(如果存在)自动扣除。

　　(1)手持式拉曼用于假冒生物制剂检测（532nm激光）

　　532 nm手持式拉曼最有前途的一个新应用就是对假冒生物制剂的检测。532 nm手持系统的优越性能包括：更强的拉曼信号，水对532nm激光更低的吸收 (图1)。这两个因素的结合使532nm手持式拉曼光谱在水溶液中各种肽或蛋白质的定量分析方面具有无与伦比的能力。

图2:手持式拉曼(532 nm)对两种畅销生物制剂的检测：(a)生物制剂1;(b)生物制剂2。绿色：原药;红色：假药;黑色：缓冲或安慰剂。

　　所有案例都使用自动取样的方法，不需要很多的拉曼知识。结果显示，532nm手持式拉曼可以快速、简单、明确的鉴别原药和假冒药。同时结果也证明，532nm手持式拉曼可以为制药公司、药房等提供强大的、低成本的解决方案。

　　(2)手持拉曼用于爆炸物的检测（532nm激光）

　　全球恐怖主义数据库的数据表明, 过去十年使用爆炸装置进行恐怖袭击的数量大大增加，包括便携式拉曼等很多分析方法都被开发用来进行爆炸物以及前体和分解产物的检测。

　　图3显示：532nm手持式拉曼可以对炸药进行快速、可靠和安全的检测、鉴定和定量分析。值得注意的是，实验中的一些炸药或前体曾被认为具有“强烈荧光”(如二硝基萘)或使用手持式拉曼“很难检测” (如环三亚甲基三硝胺(RDX)、氨和硝酸铵)。

图3: 利用532nm手持式拉曼得到的爆炸物的光谱:(a)粉末状爆炸物;(b)液体爆炸物前体;(c)过氧化氢水溶液 (d)过氧化氢自动定量分析(3200-3400 cm^-1 OH-s water);(c)中放大的插图为~874 cm ^–1 OO-s H₂O₂。

　　应该注意的是，532nm激发可以在1-5s内可靠的识别和检测上述所有物质，而且与785和1064nm相比，532nm得到的拉曼信号更强。

　　相比785nm和1064nm ，532 nm的激光具有更强的散射，同时手持式拉曼系统具有更宽的光谱范围的100-4000cm-1, 更好的光谱分辨率：4-6cm-1。如此宽的光谱范围也为手持式拉曼拓展了一些新的应用，包括水溶液中分析物的自动定量。图3d直接显示了水溶液中过氧化氢的自动定量，低至< 0.1%。

　　结论

　　分析结果表明，作为手持拉曼的一个极具吸引力的选择，532 nm激发应该被重新审视，其优势包括：仪器成本降低两倍， 很多实际应用分析速度提高5-16倍， 激光功率降低 (实现炸药的安全检测，减少激光安全问题和激光诱导的样本退化，延长电池连续操作时间)，进行水和大多数有机溶剂中被分析物检测时性能优越，能够通过各种各样的玻璃和塑料容器(包括琥珀)进行分析, 光谱范围和光谱分辨率得到改善，同时也改善了光谱检测限，提高了分析精度。

　　因此，532 nm手持式拉曼光谱可以显著改善很大一部分实际应用，并扩展新的应用领域。适合的应用包括但不限于假冒生物制剂、炸药的快速检测、复杂混合物单个成分的识别、水溶液中分析物的自动定量、在水或有机溶剂中稀释的被分析物检测，以及之前一些使用手持式拉曼认为“很难检测”的多个化合物等。

　　(作者：Aleksandr V. Mikhonin, Susan Hodi, Laurence A. Nafie, Rina K. Dukor)