半路出家的程亦凡是如何取得冷冻电镜的突破性成果的？

    程亦凡，美国加州大学旧金山分校（UCSF）教授、霍华德·休斯医学研究所研究员。早年学习物理。1996年，在获得物理博士学位5年后，他转行进入结构生物学领域。2013年，他和合作者第一个用单颗粒冷冻电镜方法，将膜蛋白结构解到了近原子分辨率（3.4埃）的水平。迄今为止，程亦凡已在生命医学顶尖期刊上发表论文及综述文章达100多篇，近20篇在Nature、Cell、Science上发表。

　　然而相比绝大多数成功的科学家来说，程亦凡是人到中年才获得普遍认可。2006年，已40多岁的程亦凡才刚刚做到助理教授，也许是加州大学旧金山分校年纪最大的助理教授。

　　近期，赛先生就他的学术经历、研究课题、对结构生物学的贡献以及冷冻电镜(cryo-EM)发展趋势等问题专访了程亦凡博士。

　　程亦凡

　　赛先生：可不可以回顾一下你的研究历程？

　　程亦凡：我情况和经历可能比较特殊。我本科学的是物理。1987年刚开始在武汉大学物理系读硕士研究生时，看到当时第一篇关于准晶体发现的文章，非常激动。因为当时电镜是研究准晶体结构最有效的手段，于是决定加入王仁卉老师课题组学习电子光学理论和电镜实验技术。博士研究生的研究工作是在中科院物理所李方华老师指导下进行的，也是从事电子光学，成象理论和高分辨电镜的理论和实验技术的学习、研究和应用。博士毕业之后，我先后在挪威和德国做博士后，继续从事材料科学方面的电镜研究。

　　1996年，我转行到生物学领域。之后分别在美国和日本继续做博士后，分别在Ken Taylor和藤吉好则实验室学习冷冻电镜，研究二维晶体和膜蛋白结构。1999年底到哈佛医学院，加入Thomas Walz实验室。2003年参与解一个水通道的膜蛋白（AQP0）的结构时，获得了1.9埃的分辨率。直到2015年为止，这也还是冷冻电镜解的分辨率最高的一个结构。 2006年，我到加州大学旧金山分校(UCSF) 做助理教授，开始了自己独立的实验室工作。2010年前后开始和David Julius 实验室合作研究TRPV1（一种在疼痛和热知觉中起中心作用的蛋白质）的膜蛋白结构。

　　自从1996年进入冷冻电镜和结构生物学领域以来，我就一直对冷冻电镜技术非常感兴趣。UCSF其它几位教授，包括John Sedat和David Agard，也都是这个领域的先驱者。David Agard教授在上世纪90年代初期就参与了第一代CCD相机的研制。他在很多年前就预见到相机开发对电镜技术的重要性，也一直从事这方面的研究。在直接电子探测器(Direct ElectronDetector，一种直接电子探测器件，能够直接检测电子，而不需要像传统CCD相机那样先将电子转换成光子，然后再由CCD记录光子信号）研发的早期，就预见到了单电子计数的重要性。2009年，我们得到美国国家自然科学基金(NSF)的资助，跟Lawrence Berkeley国家实验室和 Gatan公司一起合作开发单电子计数相机。David Agard是PI，我是co-PI。我主要负责相机的后期检测和应用开发。

　　经过几年的努力，在2013年初，我们将TRPV1通道的结构解析到8埃的分辨率。随着我们在电镜技术上的突破，特别是单电子计数相机和我们自己开发的图象飘移校正技术的应用，我们很快将它的分辨率提高到了3.3-3.4埃。获得TRP通道的高分辨率结构实际上花了四年多的功夫，不是几个月时间一蹴而就的。这也是天时地利人和的结果。

　　赛先生：从你刚才叙述的研究经历来看，你更多参与的是相机方面的工作么？

　　程亦凡：也不是。我对膜蛋白一直很感兴趣，但因为我不擅长膜蛋白的二维结晶法，而当时单颗粒方法还无法用来研究较小的膜蛋白，所以有几年中断了膜蛋白研究。在我的实验室的初步建设走上轨道后，就又开始研究新的单颗粒方法，用来研究较小的膜蛋白结构。实际上，2009年时，我的实验室已把很大一部分精力转到膜蛋白领域。

　　在电镜领域，我们自己有多年的技术积累，在很多领域一直都很领先。2003年，我做过的转铁蛋白复合物在当时是最小的，分辨率也是最高的。2008年时，我们解一个700kD的蛋白酶体的结构到5埃的分辨率，观察到一个10个氨基酸大小的多肽与蛋白酶的结合。这些在当时都是领域里领先的成果。

　　赛先生：有资料显示，你是最早成功将冷冻电镜应用于解析蛋白结构的。可以这么理解么？

　　程亦凡：冷冻电镜有三四十年的历史。最早用冷冻电镜做膜蛋白是Richard Henderson等人。1975年时，二维晶体膜蛋白结构分辨率已达到了7-8埃左右。Joachim Frank不仅是单颗粒电镜的开创者，可能也是最早用这种方法解析膜蛋白结构的先行者。第一个用单颗粒冷冻电镜方法做到原子分辨率并解出未知蛋白结构的人是周正红，他在2010年用单颗粒冷冻电镜方法解出了一个以前结构未知的二十面体病毒结构。更严格地说，我实验室是第一个用单颗粒的方法，而不是结晶的方法，将膜蛋白结构解到了近原子分辨率。

　　赛先生：2013年你的成果出来之后，结构生物学家集体转向了冷冻电镜，在此之前主要是用X射线衍射法和核磁共振来研究小分子结构。为什么很多人会意识到冷冻电镜是一个更好的方法？

　　程亦凡：它的确整个改变了结构生物学的前景。结构生物学的三大技术包括X光晶体学、冷冻电镜以及核磁共振。长期以来，冷冻电镜是这三项技术里最弱的一项。因为它的分辨率一直无法提升。这跟相机是有密切关系的。电子直接探测相机出现以后，分辨率一下子就提高了，但是当时还是没有引起很多人的重视，尤其是做晶体学研究的人，因为在他们看来，核糖体可以结晶，蛋白酶体也可以结晶。

　　而TRP通道整个蛋白家族里还没有任何蛋白的晶体结构得到解析。十几年来，世界上很多晶体学实验室都在这个上面花费了大量的精力，却没有结果。TRPV1单颗粒电镜结构的获得给人们带来了很大的冲击，用X光晶体衍射法无法得到的晶体结构，冷冻电镜不需要结晶却做出来了。很多人开始重新重视起这个领域，包括施一公和颜宁，据说他们实验室的大部分人现在都在做冷冻电镜。

　　赛先生：你2009年的工作中，是哪一部分产生了重大突破使得冷冻电镜整体上有了质的飞跃呢？

　　程亦凡：从技术上说，有两个方面。其一是相机的突破。当时除了Gatan公司，还有另外两家公司（FEI和Direct Electron）也推出了直接电子探测相机。但是我们用到了独特的单电子计数技术。这个技术可以大大提高低分辨率的信噪比。这就使得相机图像的衬度能够提高很多。这是以前没有意识到的。那么这样一来，这个相机真正的优势在于做很小的蛋白。我当时第一个想到的就是做难度最大的膜蛋白。

　　其二是计算方法上的改进。美国耶鲁大学的Fred Sigworth 最早在1999年提出将最大似然法（maximumlikelihood）用于处理单颗粒电镜图象。之后经过多个实验室的改进，到Sjors Scheres将这一方法，特别是将最大似然法用于三维构相分类，在他的新程序RELION中进一步完善，使单颗粒电镜图象处理能够将冷冻电镜的图像转变为精细的分子结构，让生物学家们更简单更清晰地看到分子机器。

　　很多事情其实也是机缘巧合。 Sjors的程序刚出来的时候并没有很轰动。因为当数据质量不好的时候，Sjors程序的用途是有限的。而我们用的K2相机将图像的质量大大提高了。此时此刻正好遇到Sjors的新程序。这两样东西结合在一起，就变得异常强大了。如果说Sjors程序在三年以前出现，它不会产生那么大的影响。

　　很多人说Sjors的程序改变了结构生物学。Sjors Scheres被Nature评为2014年十大科学人物。但他的成功也得益于相机技术的突破。同样，反过来也是一样的，相机的开发让冷冻电镜有一个革命性的飞跃，但是如果光有这个，而没有计算方法上的改进，相机的功能也不会完全展现出来。

　　最后，用传统的方法，需要用生物化学的手段将样品提纯到一定纯度，有了用最大可能法进行三维构相分类之后，蛋白晶体即便没有提纯到那个纯度，我们也能解析到很好的程度。

　　赛先生：回顾当初，你觉得您最大的贡献是什么？

　　程亦凡：我觉得我很幸运。TRPV1文章的的第一作者廖茂富（现为哈佛医学院助理教授）有病毒学的背景。刚来我实验室的时候，他从来没有做过电镜，也从来没有做过计算。他的一个主要的课题，由于各种原因，一直没有大的进展。面对困难，他从来没有放弃过。在长期艰苦的工作中，他积累了很多的经验。也是因为他这种长期的积累，等到了某一个点上，一下子水到渠成。如果当时是另外一个人做这件事情的话，最终可能也能做成，但是不会有那么顺利。

　　另一位第一作者，曹二虎（现为犹他大学助理教授），有非常扎实的结构生物学基础和经验，也有多年的TRPV1研究经验。他花了很多年优化TRPV1的表达和提纯。图象飘移校正技术文章的的第一作者是现在清华大学的李雪民教授。他也是中科院物理所李方华老师的学生，有非常扎实的电镜理论和实验基础。他的兴趣一直在开发方法方面，从头到尾参与了相机的鉴定应用程序开发。他是非常聪明的科学家。

　　另外，我们在生物化学方面也一直用各种各样的办法来尝试做膜蛋白。如果我们从来没做过膜蛋白，上来直接做TRP通道，我相信也很难做到这种程度。我们也有最好的合作伙伴，UCSF的David Julius 和David Agard, 以及UCSF独特的研究环境。这些都是不可或缺的成功条件。

　　我认可自己的一点是，我做的东西，很多都是别人说做不了的。David Agard对我的评价是，这么多年来一直不被教条所束缚，总是去挑战各种极限。这也是我一贯的工作的态度。

　　赛先生：当时为什么想到去学电镜？

　　程亦凡：我是学物理出身。物理学最令人激动的时候可能是上世纪二三十年代，我们这一代人学物理时就感觉有点生不逢时。1982年，Shechtman第一次发现准晶。当时郭可信先生和张泽、王大能发表了国际上第二篇关于准晶工作的文章。当时我们就觉得一下子跟着进入了一个领域的最前沿，令人非常激动，所以很多人都开始做准晶。我也是因为受此感染，想研究准晶，而去学电镜。但是做了十年以后，就感觉有点枯燥，但不断追求的心态还在。我这时选择转行做生物，也是历史的机缘。苏联解体后，美国停掉了“星球大战”计划，全世界的物理陷入了一种空前的危机之中。很多学物理的人都找不到工作，在那个时候，很多人转去做材料，而我对材料科学兴趣不大，感觉生物对我更有挑战一些，更有吸引力。

　　赛先生：因为缺少生物学背景，有没有想到会遇到困难？

　　程亦凡：这是肯定的。但是年轻的时候很多想法还是很幼稚的，也不怕难。直到现在我都觉得什么东西都学得会。比如我经常跟学生说：“you can learn anything you want, the only questionis how much you want to learn it.”

　　我们对电子显微学的理解要远远超过很多以生物背景做冷冻电镜的人。在当时，我觉得这是我们的优势。我们的弱点是在刚转行时完全不懂生物，更不懂生物化学。但我觉得这些东西都可以学，如果你真想学，一定可以学会。所以也没有什么克服不了的困难。

　　赛先生：问一个比较现实的问题，你一直在坚持做自己喜欢的事情，但是很晚才得到认可。你是如何看待这个问题的？

　　程亦凡：我1991年博士毕业，做了5年的材料物理博士后。转行做生物时，我对自己说，我最多相当于重新读一个Ph.d，花五年十年学一个东西不算很长时间。那时候的人跟现在不太一样，少了很多浮躁。

　　重要的是，我自己很喜欢，没有想过要放弃。我家人也很支持我，跟着我在全世界跑，从来没有过怨言。很多人选择放弃，很大一部分是家庭原因。希望稳定下来，找一份稳定的工作，那么不得不做出选择。

　　我从来没有觉得自己比别人晚了很多。我一直觉得自己很幸运。

　　赛先生：UCSF对教员的压力是不是没有那么大？

　　程亦凡：UCSF的环境非常独特。我2006年才做助理教授。我当时的年纪在国内恐怕是找不到类似的工作的。另外，UCSF很赞赏我这种背景。我当时在美国其他地方找工作，经常碰到的评价是，你是物理学家，不懂生物学。我到UCSF面试的时候，我说我是一个物理学家，当时的系主任接的第一句话是：That’s great, you know things we don’t know。

　　这也是我当时选择UCSF的一个主要原因，它给你的支持，不是说给了你多少资源，而是它对待你的宽容。我拿到终身教职的时候，我的这些文章都没有，这个时候他会看个人的潜力。给了我这种环境，却始终没有给过我任何压力。

　　赛先生：冷冻电镜突破之后，目前的工作主要在哪一块？今后有哪些让你觉得兴奋的工作？

　　程亦凡：当然有。我们实验室主要的工作还是专注在膜蛋白上。我感觉自己越来越像一个生物学家。我并不满足于只解析出结构，还希望能够理解它。所以TRP channel一直是我们实验室的一个主要方向。另外一方面，我也希望方法上能有所提高。比如提高分辨率。我也希望能够把蛋白做到更小，比如到100kDa以下。

　　赛先生：有人把你和张益唐老师做了一个对比。因为你们都是1978级的毕业生。这一代人身上有三个特点：坚韧、有榜样的力量来鼓舞、不屈不挠必须把事情做成的心态。

　　程亦凡：我看到过这种比较，某种程度上讲也许有一定道理，但也并不完全是。有道理是说，因为我们这代人经历的东西太多，我们经历过文化大革命，也见证了整个国家由改革开放带来的变迁，以及经济和科研上的由弱变强。也许是这些经历造成了我们这一代人身上的这些相似的特点。我想不同的是，我自己觉得我还是比较顺利的，一直都在做我喜欢做的科学，从来没有想过要放弃，所以也没觉得有多难。

　　另外，每个人对成功的理解不一样。我觉得自己一直都挺成功的，并不是直到解了TRPV1结构才是成功了。对我来说，2003年发第一篇Cell文章，2006年拿到助理教授的位置，建立自己的实验室，2008年解蛋白酶体到5埃分辩率，到2012年拿到终身教职，和2015年当上霍华德·休斯医学研究所研究员，还有我拿到的每一个grant，发的每一篇文章，每一步都是成功。当然也有很多想做而没做成的事，想拿而没拿到的grant，想发而没发了的文章，也有很多想做而没法做或没做成功的实验，等等，等等。这些成功与不成功都不会停在某一个点上，而是还会不停地继续下去。