荧光简介

荧光是一种效应，1852年George Gabriel Stokes首次对其进行描述。他发现，萤石在紫外线照射下开始发光。荧光是一种光致发光形式，光致发光是一种材料以光照射后发射光子的现象。发射光的波长比激发光长。这种效应称为斯托克斯位移。

Wymke Ockenga

德国马尔堡菲利普斯大学细胞生物学与细胞病理学研究所 

An Introduction to Fluorescence - Original Article Leica Science Lab.

荧光用作显微技术的工具

荧光广泛应用于显微技术中，并用作观察特定分子分布的重要工具。细胞中大部分分子不发荧光。因此，它们必须以荧光分子（荧光物）标记。目标分子可以直接标记（比如DNA使用DAPI标记），或用与特定抗体结合的荧光物进行免疫染色。免疫染色通常需要固定细胞。

荧光显微技术还可用于活细胞或组织的延时成像。为此，可用基因编码的荧光分子（如GFP，绿色荧光蛋白）标记目标蛋白。还可以用可逆结合的合成染料（如fura-2）或转基因天然存在蛋白（如GFP衍生物）标记目标分子（如Ca2+）。

电子能态的改变导致发冷光

发冷光即发生光效应，由电子从激发态转移到较低能态而引起。电子可以以不同的能态存在。基态是电子非常稳定的状态，这时电子的能量最低。如果电子吸收能量，它们可以跃迁至较高的能级，即激发态。由于激发态的能量多于基态，电子返回其基态时必须释放能量。能量可以通过发射光子的形式释放。

发冷光有若干种形式，不同点在于系统的激发方式。例如，在电致发光中，系统由电流激发；化学发光是因为发生化学反应；而光致发光由光子激发引起。

光致发光可以进一步分为两个亚组，即荧光和磷光。荧光与磷光之间的主要差异是发光的持续时间。光照停止时，荧光立刻结束。相较之下，磷光可在激发结束后持续数小时。

荧光机理

以对应波长的光照射时，荧光物才发荧光。波长取决于荧光团的吸收光谱，而且必须确保传递适当数量的能量，以将电子提升至激发态。电子被激发后，它们停留在这个高能态的时间非常短。电子经过弛豫过程回到基态或能级较低的另一个状态时，能量以光子形式释放。这个过程损失一些能量，相较于被吸收的光，荧光物发射的光波长较大且能量较低。

磷光机理

磷光分子的发光时间明显长于荧光物，因此它们储存激发能的途径肯定不一样。产生这种差异的根本原因是存在两种形式的激发能级，即单重激发态和三重激发态，它们基于不同的自旋排列。

自旋是电子的一个属性。简言之，自旋描述电子本身旋转造成的角动量。电子自旋的方向可以是正的（+1/2），也可以是负的（–1/2）。高能级自旋对的彼此朝向可以是平行的，也可以是反平行的。在反平行自旋对中，各个角动量互相补偿，总自旋的值为零。这种自旋排列称为单重态。两个平行的自旋没有补偿效应，数值不等于零。在这种情况下，自旋处在三重态中。

电子从单重激发态回到基态时产生荧光。但是，在一些分子中，激发电子的自旋可以转变为三重态，这个过程称为系间窜越。这些电子损失能量，直至它们处于三重基态。这个状态的能量高于基态，但低于单重激发态。因此，电子不能转回到单重态，也不能轻易地回到基态，因为由于量子力学的缘故，只允许数值为零的总自旋。所以，分子被其能态捕捉。

但是，每次也会发生从三重基态返回基态的现象。这些变化引起光子释放，产生磷光。由于每次只能出现一些变化，因此三重基态起到能量库的作用，从而可在较长时间内产生磷光。

发冷光在显微技术中的应用

对于显微技术，荧光是最有用的发光类型。通过特定光源（如灯和滤光系统或激光），可以使用特定的波长轻松地激发荧光物，而且可以通过波长区分发射光和激发光（斯托克斯位移）。

实验人员可以使用荧光成像来表征细胞内某种分子的数量和定位。荧光显微技术的另一个优点是可以同时使用若干个荧光物。只要求荧光物的激发波长和发射波长不一样。因此，可以同时观察不同的目标分子，这意味着可以同时进行众多研究，例如共存研究。