1  前言

2013 年1 月，新西兰牛奶及奶制品被检测出含有低含量的有毒物质双氰胺(二氰二氨Dicyanodiamide，DCD），已经下令禁售含有DCD的奶制品。中国的进口奶粉八成来自新西兰，全球60%以上的奶源产自新西兰。新西兰奶农通常会在牧草上喷洒双氰胺，防止肥料中的副产品硝酸盐流入河流和湖泊。
 
目前，还没有相应的食品含量标准和检测标准。默克密理博致力于分析方法的开发，为客户提供简便、快速的解决方案。双氰胺极性较强，易溶于水，中性及酸性条件下易电离，适合使用默克密理博的两性离子型亲水作用(ZIC®-HILIC)色谱柱分离。同时，双氰胺在218nm下有强紫外吸收，可以采用ZIC®-HILIC 色谱柱在HPLC-UV条件进行快速分析，亦可在LC-MS/MS进行痕量检测。
 

2 仪器及试剂

2.1 仪器设备

2.1.1 色谱柱：ZIC®-HILIC, PEEK HPLC Column 250 x 4.6 mm, 5 μm, 200 Å（1.50458.0001）
2.1.2 HPLC：Agilent 1260HPLC(DAD检测器)
2.1.3 单道移液器Transferpette®S，Digital adjustable 500-5000ul（Brand：BR704782）
2.1.4 微孔滤膜:0.45um,PTFE(Millipore：SLFHX13NL)
2.1.5 纯水系统:Milli-Q3（Millipore）
2.1.6 PP离心管：50mL,带盖，含底座（货号:114822BR）

2.2 试剂

2.2.1 色谱乙腈:LichroSolv®Acetonitrile Gradient Grade（1.00030.4008）
2.2.2 乙酸铵：Ammonium acetate for analysis EMSURE® ACS,Reag. Ph Eur（1.01116.1000）
2.2.3 甲酸：Formic acid 98-100% for analysis EMSURE® ACS,Reag. Ph Eur（1.00264.1000）
2.2.4 2%甲酸溶液：取20ml甲酸，加入1000ml超纯水中
2.2.5 乙腈-甲酸溶液：取700ml乙腈（2.2.1）,与300ml 甲酸溶液（2.2.4）混合

3 实验方法

3.1 样品处理

方法1:
取婴幼儿配方奶粉2g于50mL PP管（2.1.6）中，加18mL 2%的甲酸水溶液，加盖密闭。摇振60秒，再超声30分钟，取出，再摇振60秒，放入离心机中离心（4000转），20分钟。取出，吸取上清液50ul，于10ml PP管中，加入950ul乙腈，加盖密闭，振摇60秒，吸取溶液，过滤，即得供试液。
方法2：
取婴幼儿配方奶粉2g于50mL PP管中，加20mL 乙腈-甲酸水溶液（2.2.4），加盖密闭。摇振60秒，再超声30分钟，取出，再摇振60秒，静置，吸取上层溶液，过滤，即得供试液。
加标样品同法配制。

3.2 测试条件

3.2.1 色谱条件
流动相 (v/v): A-醋酸铵溶液（10 mM）,B-乙腈
比例*：A:B=12：88
流速:1 mL/min
进样量：20ul
*必要时设置如下方法对色谱柱进行再生和平衡：

时间，min	%	%	流速 ml/min
0	12	88	1	等度
10	12	88	1	等度
10.5	30	70	2	再生
15	30	70	2	再生
15.1	12	88	2	平衡
20	2	88	2	平衡

3.3 测试结果
按照方法1处理，结果如下：
 3.3.1 对照品图谱  
3.3.2 无检出的奶粉空白 3.3.3 奶粉加标
3.3.4 某知名品牌奶粉

4 结论

采用ZIC®-HILIC色谱柱，可用于双氰胺的快速检测。处理方法简单，色谱峰型良好，方法重现性良好（RSD<2%）,检测浓度在0.5-10ug/ml之间现行关系良好(R=0.999),加样回收率在95.6-101.5%之间。按照方法1的处理，LOD为1.3ug/g奶粉，按照方法二处理,LOD可达0.07ug/g。
该色谱柱还能用于三聚氰胺、双氰胺、三聚氰酸、二甲双胍、尿素等的同时检测，如： 另外，LC-MS/MS采用如下色谱条件：
色谱柱：ZIC®-HILIC (5 µm, 200Å) PEEK 150x2.1 mm
流动相：A: 95:5 ACN:0.1% formic acid/10 mM ammonium formate in H2O
B: 50:50 ACN:0.1% formic acid/10 mM ammonium formate in H2O

梯度方法

Time (min)	Solution A (%)	Solution B (%)	Flow rate (mL/min)	Elution
0.0-5.0	100	0	0.400	isocratic
5.0-12.8	100-25	0-75	0.400	gradient
12.8-15.8	25	75	0.400	isocratic
15.8-16.0	100	0	0.400	equilibration
16.0-24.9	100	0	0.600	equilibration
24.9-25.0	100	0	0.400	equilibration

详细方法可参考：

• FDA Laboratory Information Bulletin 4487
• Journal of Chromatography A 1220 (2012) 101–107

更多详情，请拨打默克密理博实验室基础业务 400-889-1988