3D细胞培养分析技术微孔板制备的新视角

    阿斯利康中国创新研究中心（ICC）的科学家们开发了一项新技术，利用Tecan 全自动液体处理工作站Freedom EVO^®进行细胞培养微孔板自动化温控制备，进而完成药物候选化合物筛选。该研究团队在BD Matrigel™加样前使用琼脂预涂微孔板，从而顺利地在96孔微孔板上实现3D细胞培养分析。
 
    中国创新研究中心（ICC）是阿斯利康在中国上海张江高科技园区投建的研发基地。该中心于2007年正式投入使用，专注于调查研究影响亚洲人口健康的各类疾病，其中包括：胃癌、肝癌以及肺癌。该中心采用国际一流的先进技术解析这些癌症的遗传机理，并在临床上识别及确证相关的生物标记物和药物靶标。

    由Yi Gu博士带领的细胞科学研究部门正在对这些疾病开展一项药物研究项目，希望通过筛选多种化合物来确定候选药物。3D细胞检测分析是该项目组基于采用BD Matrigel (BD Biosciences)作为细胞培养底物进行的二次药筛技术其中的一种。Matrigel是从EHS (Engelbreth-Holm-Swarm)小鼠肉瘤的可溶性基底膜抽提得到的细胞外蛋白凝胶复合物，能够诱导克隆细胞在标准细胞培养基表面通过不同方式生长（图1）。这些非均相构成诱发了克隆体的形成，非常适用于研究肿瘤细胞之间的粘附、生长、迁移及转移。由于克隆细胞很好地模仿了人体组织的生长与成型过程，因此研究人员能够在药筛最初期识别正确的化合物。
 
    手工制板存在着明显的两个缺陷：容易出错且耗费时间，而通过使用全自动液体处理工作站Freedom EVO来提高检测通量并改善结果的一致性，无疑是最好的解决方案。这一自动化平台早已成熟应用于化合物梯度稀释和其他大量细胞检测实验中，可以在保持原有应用的基础上快速且低成本地修改应用程序。
 
    ICC资深自动化科学家William Shi解释说：“历来此类3D细胞检测都是在6孔板上进行的，由于样本需求量大且Matrigel底物处理比较复杂，因此手工制板十分困难。并且，这种6孔板型无法与大量试剂需求和大批量化合物筛选工作相匹配，因此我们开始着手不断寻找高性价比的方法。另一点很重要的是，Matrigel的异质组分具有较大表面张力且在微孔内分布不均，其低剂量加样非常困难，因此分析6孔板上的实验结果已经极其困难，更别提在96孔板内检测分析了。为了解决这一问题，我们先在微孔板上预涂一层薄薄的琼脂，然后再进行Matrigel加样。这种方法虽然解决了Matrigel的表面张力问题，却带来了如何平衡在50℃以下琼脂凝固与４℃以上Matrigel过度粘稠这两种物质的复杂加样问题。”
 
    后来我们选用了全自动化液体处理工作站Freedom EVO，其中选配了多个温控载架，使得盛装琼脂和Matrigel的液槽一直保持适宜的温度，非常便于加样。整个加样过程都是由自动化系统的液体处理机械臂（LiHa）上的单通道完成，通过多次洗液注液循环实现预热或预冷，避免加样针堵塞。加样初期通过机械臂的多次注液将预热琼脂（55℃左右）加入提前预热的96孔板内，这样可以将琼脂冷却的可能性降到最低点，从而减少琼脂的用量，降低实验成本。随后，微孔板在载板架上经室温冷却15-20分钟，使得琼脂在加入Matrigel前得以凝固。

     采用这种解决方案后，能在短短90分钟内完成6块微孔板的加样制备，而传统手工处理一天仅能完成3-4块微孔板的加样，两者形成鲜明对比。制备好的微孔板质量在使用自动化加样技术后也有了很大提升，避免了人工制板常出现的批对批、板对板、甚至孔对孔的误差问题。William总结道：“这种高度一致性对药物筛选来说至关重要，高质量的实验结果数据有助于我们加快药物研发进程，Freedom EVO自动化平台独具的灵活性使得这一切能够轻松实现！”

更多关于Tecan　Freedom EVO液体处理工作站的信息请访问以下网站或询问当地Tecan员工／经销商：www.tecan.com/freedomevo
 
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BD和Matrigel是美国BD公司（Becton, Dickinson and Company）的注册商标。
Corining是美国康宁公司（Corining）的注册商标。

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