德国耶拿:高速PCR之典范SpeedCycler2

 高速PCR之典范SpeedCycler2
吴潇韫王忠华
(德国耶拿分析仪器股份公司)  

摘要 本文介绍了德国耶拿分析仪器股份公司生产的高速PCR的SpeedCycler2的性能特点和应用。重点介绍了如何通过提高PCR升降温速度，提高模块温度与样品溶液温度一致性，来极大地降低每个PCR循环的时间，从而达到提高整个PCR反应速度的目的。指出了高速PCR提高PCR 产物的特异性的可能性。同时也列举了高速PCR在人类基因组学，长片段DNA植物基因组学，及在法庭科学等方面应用，指出了高速PCR技术为各项基因研究可能带来的新的进步。
关键词 高速PCR、自适应技术、软件自控技术     
中图分类号TH77

SpeedCycler2 with Rapid PCR Technology
Wu Xiaoyun，Wang Zhonghua
（Analytik Jena China Office）

Abstract The specification and application of one typical rapid PCR instruments SpeedCycler2 ，made by Analytik-jena.AG, Germany, are described. It is introduced that how SpeedCycler2 increased the PCR speed by increasing the PCR ramp rate, and decreasing the temperature  difference between the PCR module and sample solution. The possible increasing of PCR specificity is also introduced. Some application of rapid PCR in Human Genome, long piece DNA research in Plant Genome, and forensic are listed, and the possible progress in gene research by using rapid PCR was concluded.

Key words Rapid PCR; Self-Adapting Container Technology; Software Adaption Controlling Technology
  高速PCR技术(Polymerase chain reaction：聚合酶链反应，即是在体外模拟体内DNA复制的过程)说起来已不是一项最新的技术，因为德国耶拿分析仪器股份公司在2003年即拥有了高速PCR技术，并据此开发出了第一代高速PCR仪SpeedCycler，而今天SpeedCycler已被新一代的SpeedCycler2所更新换代。SpeedCycler2可以说是目前面市的历经考验的速度最快的PCR仪，本文将对这款PCR仪的性能特点、具体应用等做一概要介绍。
1.SpeedCycler2主要性能特点

图1. SpeedCycler2 高速PCR仪

  SpeedCycler2高速PCR仪具有高速、高效、高质量产物、配置灵活等多项优点，采用镀金纯银槽和高品质帕尔帖（Peltier）控温，升降温速率最高可达15℃/s和10℃/s。如大家所熟知，要提高PCR反应速度，仅提高PCR仪的升降温速度是不够的，因为在每个PCR循环中的变性、退火、延伸温度上的停留时间是决定PCR总耗时的另一个主要因素。专利性的自适应技术（Self-Adapting Container Technology，SAC）实现90%以上的热能利用率，能使常规的30s—30s—60s的PCR程序缩短为2s-2s-10s甚至更短，最快15min即可完成一个常规PCR实验。同时由于样品温度在非常短的时间内能达到设定温度，大大缩短退火时间，因此高速PCR带来的另一个好处是可有效防止引物错配，提高扩增产物特异性。
  SpeedCycler2有两大类共四种热反应模块供用户选择，配置非常灵活，并都能实现高速PCR。两大类不同的热反应模块，与之相对应适用两种不同的PCR反应耗材。一种模块叫低缘紧凑型快速模块（Low-Profile-Rapid，LPR，见图2），其特点是样品槽浅、孔径小、孔间距小、孔容积小，可以视为标准PCR模块的缩小版，配套的耗材也是低缘紧凑型的超薄壁PCR板。之所以设计这样的独特模块，一方面是为了实现在能量一定的前提下，通过降低单管样品量和减少样品管覆盖面来提高能量的利用率，进而实现温度的快速变化，另一方面，低缘紧凑型模块是高速PCR专利性的核心技术之一自适应技术（Self-Adapting Container Technology，SAC）实现的前提。样品管高度低，管内空气受热膨胀进而施加到管壁上的压力大，而LP耗材管壁本身又超薄又富有弹性，这样就可以在PCR反应过程中使样品管壁紧密贴合在样品槽壁上，进而大大提高热传递效率，加快样品热量的交换传递，体现出高速的升降温速率变化和短暂的温度停留时间。

          
图2. 96孔LPR模块                  图3. 96孔SPR模块

  SpeedCycler2另一种热反应模块为标准型快速模块（Standard-Profile-Rapid，SPR，见图3）。标准型，即其模块构型和普通PCR仪是一样的，所使用的耗材也是通用型的PCR管或板。那么，为何用普通的PCR反应槽和耗材也能实现高速PCR呢？除了采用热传导性非常好的镀金纯银槽、温度变化快速的帕尔贴控温部件外，耶拿公司采用了另一种实现高速PCR的核心技术，即软件自控技术（Software Adaption Controlling, SAC），通过软件调节帕尔贴的加热功率来实现用较厚管壁的PCR耗材也同样能完成高速PCR。
  图4比较形象地解释了软件自控技术的原理，正如用薄壁锅和厚壁锅烧开水，在同样量的水、同样的火力加热条件下，薄壁锅把水烧开所需要的时间少于厚壁锅，因为热量传递更快，但如果我们加大厚壁锅的火力，在更短的时间内把水烧开也是完全有可能的。所以当采用比较厚壁的PCR耗材在SpeedCycler2进行PCR反应时，我们只需通过软件来调控仪器的加热和制冷功率，同样保证了样品温度与模块温度的一致性，因而能在30min内完成30个循环，从而实现高速的PCR实验。

        

                         图4.借用不同锅烧开水的示意图来解释软件自控技术原理
  SpeedCycler2除了通过快速的升降温和高效的热传递来实现高速PCR外，还有众多的优点来提高扩增产物的质量，提升用户的体验。
  比如非常有用的SPS样品保护技术，仪器启动运行后，首先是热盖快速升温，样品槽温度维持在室温不变，直到热盖升温到设定温度比如110℃后模块才开始升温，这样可以保持样品上部的温度一直比下部的高，样品就不会有蒸发，即使5µL的反应体系也能得到很好的扩增效果。
  比如可以设置温度和时间随着每个循环的进行而增减，像进行Touchdown PCR实验，逐步降低退火温度来提高扩增产物的特异性，还可以使每个循环中的延伸时间不断增加，以弥补DNA聚合酶活力的降低，提高扩增效率。
再比如具有断电自动重启功能，一旦在PCR运行过程中断电，仪器会自动记录运行状态，再次通电后PCR反应会从断电前的最后一个循环的变性步骤开始继续进行，这样可以减少非特异性扩增产物。
  SpeedCycler2有96孔、48孔、36孔等多种通量的模块供用户选择，配的5.7英寸彩色触摸操控器HID-Pro 320，基于Window CE的操作系统，界面简洁清晰，操作方便，运行情况一目了然，具有USB、RS 232、LAN等多种接口，便于数据的传输存储，同时SpeedCycler2还可以直接连接电脑使用，方便程序和结果的管理。
2.SpeedCycler2高速PCR应用
  在半个小时之内完成PCR反应，对很多PCR实验者来说是一件不可思议的事情，他们在接触高速PCR技术时的第一反应通常是“这么快，扩增效果怎么样？”，下面就举几个用SpeedCycler2来进行高速PCR的实验例子，看看高速PCR在快速的同时还能保证非常好的扩增效率。

图5. 1kb lambda DNA用SpeedCycler2扩增，总共用时24min。Marker分别为1500/850/400/200/50bp。

  图5实验中扩增1kb的lambda DNA，模板量0.1ng，采用耶拿公司普通的innuTaq DNA聚合酶，20µL的反应体系，PCR仪为耶拿公司的高速PCR仪SpeedCycler2，PCR程序为预变性95℃120s，95℃2s，58℃2s，72℃10s，30个循环，最后72℃60s，设置的仪器升降温速率分别为12℃/s和8℃/s，完成整个PCR过程只需要24min，其产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图5。
  我们再来看一个扩增小片段的例子，可以进一步地缩短PCR时间。目的基因分别为210bp和536bp的人类β-球蛋白基因片段，模板量1.2ng，采用耶拿公司的innuTaq HOT A DNA聚合酶，20µL的反应体系，PCR仪为耶拿公司的高速PCR仪SpeedCycler2，PCR程序为预变性96℃30s，96℃0s，56℃0s，30个循环，最后72℃30s，仪器升降温速率分别为12℃/s和8℃/s，最终完成整个PCR过程仅需要14min，其产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图6。

 

图6. 210bp和536bp的DNA用高速PCR扩增，总共用时14min。Marker分别为1500/850/400/200/50bp

  高速PCR的省时优势在扩增长片段方面发挥得更为明显。图7是一个扩增长片段的PCR对比实验，采用普通PCR技术和高速PCR技术分别扩增一个24kb的人类基因组片段，由于仪器的热传递性能不同，所以采用的PCR扩增程序也有所不同，普通PCR程序为预变性94℃180s，94℃15s，65℃30s，68℃23min，30个循环，最后68℃180s，完成整个PCR程序用了8h 22min，而高速PCR程序为预变性94℃180s，94℃15s，65℃30s，68℃10min，30个循环，最后68℃60s，完成整个PCR程序只用了4h 59min，比普通PCR节省了约42%的时间即3h 30min，相当于半个工作日，这无疑是速度上巨大的提高，能大大提高PCR使用者的工作效率。
                                     Marker   高速PCR   普通PCR
                                              4h59min   8h22min

图7. 高速PCR和普通PCR在扩增24kb长片段的对比

  微卫星（microsatellite analysis）即短串联重复序列(short tandem repeat，STR)由于在人类基因组中具有广泛性、高度保守性、高度多态性等特点，被广泛用于分类学研究、物种的系统发育、造血干细胞移植以及亲子鉴等方面，而高速PCR技术因其扩增特异性好、反应速度快在STR的多重PCR检测中发挥了优势作用。Promega PowerPlex 16 system kit是一个通过3色荧光标记来检测16个基因座（15个STR位点和1个性别位点）的多重PCR试剂盒，系统内的基因座包括，Penta E，D18S51，D21S11，TH01，D3S1358，FGA，TPOX，D8S1179，vWA，Amelogenin，PentaD，CSF1PO，D16S539，D7S820，D13S317和D5S818。在这些位点中，Penta E，D18S51，D21S11，TH01和D3S1358的特异引物采用荧光素（FL）标记；FGA，TPOX，D8S1179，vWA和Amelogenin的特异引物使用TMR标记；Penta D，CSF1POD16S539，D7S820，D13S317和D5S818的特异引物使用JOE标记。全部的16个位点在同一PCR管中在高速PCR仪SpeedCycler2上同时进行扩增，然后通过测序分析。PCR扩增程序为：第一步95℃11min，96℃1min，第二步94℃30s，60℃30s，70℃45s，循环10次，第三步90℃30s，60℃30s，70℃45s，循环22次，第四步60℃30min，总时间约2h，图8显示的是16个基因座PCR后的检测结果，可以看出16重的PCR扩增效果和特异性都非常好。

图8. 16重STR 高速PCR的测序结果 荧光素标记的基因座 JOE标记的基因座 TMR标记的基因座

3.结束语
  SpeedCycler2高速PCR仪凭借快速、高特异性扩增、灵活的配置、精湛的工艺等特点，一经推出迅速吸引了众多生命科学工作者的眼球，在全球跨入高铁时代的时候，SpeedCycler2也将引领PCR技术进入高速PCR时代。