ACQUIT Y UPLC-ELSD测定奶粉和牛奶中八种糖的含量

ACQUIT Y UPLC-ELSD测定奶粉和牛奶中八种糖的含量
赵淑军 沃特世公司，上海，中国

关键词：
超高效液相色谱 奶粉 牛奶 Fructose(果糖)Sorbose（山梨糖)
Glucose(葡萄糖)Sucrose(蔗糖)Maltose(麦芽糖)Lactose(乳糖)
Maltotriose(麦芽三糖) Maltotetraose(麦芽四糖)

实验方法

材料、试剂和仪器
乙腈为色谱纯，三乙胺为优级纯，实验用水为超纯水
(18MΩ,TOC3ppb)，ACQUITY UPLC®超高效液相色谱系统，Acquity
ELSD检测器,(FILTER MIXER (425μl,P/N 205000403),可不用)。

色谱条件
液相系统： Waters ACQUITY UPLC®
配ACQUITY ELSD 蒸发光散射检测器
色谱柱： AACQUITY UPLC BEH Amide 2.1mm x 100mm，
1.7 μm, P/N:186004801
柱温： 35˚C
分析时间 ： 18 min
进样量： 5ul(样品进样2ul)
流动相： A:水
B:0.2%TEA乙腈溶液;梯度洗脱
弱洗溶剂： 乙腈/水=90/10，800μl
强洗溶剂： 乙腈/水=10/90，500μl
进样方式： 不充满定量环（使用针溢出）
ELSD条件：
增益： 500
数据率： 10pps
喷雾器模式： 冷却
漂移管温度： 55˚C
气体压力： 30psi
实验室试验温度： 20˚C
实验室试验湿度： 45%
工作电源： 220V稳定电源
梯度方法见下表：
时间/(min) 流量/(ml/min) A% B% 曲线
0 0.15 15 85 初始
2 0.15 22 78 6
11 0.15 50 50 4
18 0.15 15 85 1

数据处理系统
Empower 2
前处理方法
称取2.0 g奶粉样品或5ml液态奶样品，加入20mL(对于液态奶添加15ml)1/1的乙腈水溶液溶解，手摇震荡混匀，然后涡旋混匀2分钟，室温下8000r/min离心15分钟，取上清液过0.2μm滤膜；对于某些样品由于糖含量很高，所以过滤后的样品可能需要用乙腈/水=70/30的溶液稀释一定倍数后，进样检测。

结果与讨论
标准配制
八种糖标准分别称取10mg，用1/1的乙腈水定容至1ml，然后用乙腈/水=70/30的溶液稀释配制各个浓度的标准品，进行实验。
八种糖UPLC分离检测色谱图及数据

图 1. 八种糖UPLC分离检测色谱图

图1是八种糖50ppm混合标准品用UPLC(ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱)分离，ELSD检测的色谱图，按照保留时间顺序分别是：Fructose(果糖)、Sorbose(山梨糖)、Glucose(葡萄糖)、Sucrose(蔗糖)、Maltose(麦芽糖)、Lactose(乳糖)、Maltotriose(麦芽三糖)、Maltotetraose(麦芽四糖)；包括5种单糖和3种多糖。有关数据见下表。

其中较难分离的Fructose(果糖)和Sorbose(山梨糖)、Maltose(麦芽糖)和Lactose(乳糖)均分别达到1.6、1.5的分离度。

方法的检出限

如图2所示，为5ppm的混标色谱图，此浓度下按保留时间顺序八种糖的信噪比分别达到3、5、5、24、6、12、5和3，(进样量10ul）：

可见，八种糖中Fructose(果糖)、Sorbose(山梨糖)、Glucose(葡萄糖)、Maltose(麦芽糖)、Maltotriose(麦芽三糖)和Maltotetraose(麦芽四糖)的检测限为5ppm；此浓度下Lactose(乳糖)可达到定量限，而Sucrose(蔗糖)的定量限可以到达2ppm。

方法的线性相关性

浓度分别为5.000、10.000、20.000、50.000、100.000、150.000mg/L的八种糖标准品依次进样，进样量均为5μL，外标法定量。以峰面积A的lg值为纵坐标，浓度C的lg值为横坐标进行线性回归，得到8种糖的线性方程、复相关系数和线性曲线图如图3-图10所示，在5.000-150.000 mg/L范围8种糖均具有良好的lg-lg线性关系。

实际样品检测结果
从市场取某一奶粉样品，进行实际提取实验，进样检测，色谱图及结果数据见图11所示，可以看出此样品中含有蔗糖、乳糖、麦芽三糖和麦芽四糖四种糖成分，同时发现蔗糖和乳糖的含量相当高，已经超出检测器的响应范围；因此将此样品稀释100倍后再次进样检测，结果数据见图12。

由图11和12的数据可以知道此奶粉中含有蔗糖16.8mg/g、乳糖140.1 mg/g、麦芽三糖和麦芽四糖的含量分别只有1.9 mg/g、1.3mg/g。某液态奶提取后，稀释100倍检测结果见图13。

重现性
首先用50ppm混合标准6次连续重复进样，考察标准品在本方法下的稳定性，见图14所示重叠色谱图，重复数据见表3、表4。

提取奶粉实际样品，由于乳糖含量较高，将其稀释了100倍，然后在不同天次连续3天进样检测，考察本方法对于实际样品日间的重现性情况，如图15所示是该实际样品3天内3次进样的重叠色谱图，由图可见该方法对实际样品在日间具有较好的重现性。

结论
本方法建立了用Waters UPLC-ELSD系统检测奶粉和牛奶实际样品中Fructose(果糖)、Sorbose(山梨糖)、Glucose(葡萄糖)、Sucrose(蔗糖)、Maltose(麦芽糖)、Lactose(乳糖)、Maltotriose(麦芽三糖)、Maltotetraose(麦芽四糖)8种常见糖的的定量分析方法。方法的检出限:有6种糖达到5μg/g，另外两种糖Sucrose和Lactose在5μg/g下的信噪比可达到24和12。使用ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱和三乙胺流动相体系，8种糖均实现基线分离，可以用于奶粉和牛奶中常见这8种糖的含量测定。

参考文献：
Waters ACQUITY UPLC BEH Amide Columns Care & Use，P/N:715001371