博纳艾杰尔成功开发出奶粉中激素样品前处理方法

       奶粉激素事件牵动着大家的关注！ 凭借材料研发的优势，博纳艾杰尔研发中心的技术人员们已经成功地开发了两种从奶粉中提取激素的样品前处理固相萃取柱，Cleanert PEP和Cleanert CM Silica，并成功地用于雌酮、雌二醇、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮等四种激素的检测。数据表明：改方法具有快速、准确、简单等特点，而且回收率高、成本低。藉此我们希望抛砖引玉，让从事方法开发的同行们共同探讨，完善方法。

奶粉中雌酮、雌二醇、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮 SPE-LC/MS/MS检测方法

1．实验部分：
1.1材料、试剂
Cleanert PEP吡咯烷酮化聚苯乙烯/二乙烯基苯固相萃取柱(100mg/6mL, P/N: PE1006，博纳艾杰尔科技)；Cleanert Silica CM改性硅胶固相萃取柱 ( 1000mg/6mL , P/N : CM0006，博纳艾杰尔科技)
液相色谱柱 (Halo C18 , 2.1×100mm, 2.7μm, P/N: 92812-602，博纳艾杰尔科技）
标准品：雌酮（CAS.No. 53-16-7）、雌二醇（CAS.No. 50-28-2）、醋酸甲地孕酮（CAS.No. 595-33-5）、醋酸氯地孕酮 (CAS.No. 302-22-7 )，购自中国药品生物制品检定所。
1.2样品前处理方法
1.2.1 Cleanert PEP样品提取净化法
提取：取2g奶粉，加标，然后加12mL 80% 乙腈，涡旋混匀两分钟后，离心（90000r/min， 6min）取3mL上清液，加入9mL超纯水稀释，涡旋混匀后，待过Cleanert PEP柱净化。
净化步骤：
1) 活化：以5mL乙腈，5mL水活化Cleanrt PEP；
2) 上样：把上述稀释后的样品溶液过柱，流速控制以1mL/min为宜；
3) 淋洗：待样品溶液完全通过小柱后，用5mL 5%乙腈淋洗小柱，然后真空抽干3min；
4) 洗脱：以3-5mL乙腈洗脱目标，收集流出液；
5) 浓缩：收集液以氮气浓度吹干（40℃水浴），后以50% 甲醇水定容至1mL，混匀后过0.22μm微孔滤膜过，进LC-MS/MS分析。
1.2.2 Cleanert Silica样品提取净化法
提取：取2g奶粉，加标，然后加12mL 乙腈，涡旋混匀两分钟后，离心（90000r/min， 6min）取3mL上清液，待过Cleanert Silica柱净化。
净化步骤：
1) 活化：以5mL乙腈活化Cleanrt Silica小柱；
2) 上样：把上述提取液过柱，收集流出液；
3) 淋洗：以5mL乙腈洗涤小柱，收集流出液；
4) 浓缩：合并以上流出液液，以氮气浓度吹干（40℃水浴），后以50% 甲醇水定容至1mL混匀后过0.22μm微孔滤膜，进LC-MS/MS分析。
1.3 LC-MS/MS检测条件
1.3.1 孕激素（醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮）测定
液相色谱条件：色谱柱 (Halo C18， 2.1×100mm, 2.7μm)；流动相：A：0.1%甲酸水，B: 甲醇，梯度条件（略）；流速：0.3mL/min，柱温：40℃,进样量：10μL
参考质谱条件：电离源：电喷雾正离子模式；其他（略）
1.3.2 雌激素（雌二醇、雌酮）测定
液相色谱条件：色谱柱（Halo C18 2.1×100mm,2.7μm）；流动相：A：水，B: 乙腈，梯度条件（略）；流速：0.3mL/min，柱温：40℃, 进样量：10μL
参考质谱条件：电离源：电喷雾负离子模式；其他（略）
2．结果与讨论：
结果见图1、图2。用Cleanert PEP (反相)或Cleanert Silica CM(正相) 两种净化手段均可到达满意的回收率和净化效果，添加浓度在25ppb时回收率可达到80% 。
用Halo色谱柱可以实现样品的快速分离，大大提高工作效率。
雌二醇和雌酮两种激素，质谱相应偏低，质谱条件需要进一步优化。
本实验结果采用单点定量判定，结果可能有失偏颇，详细数据需做基质添加标准曲线确证，方法的精密度，稳定性等亦需要进一步确证。 

图1 两种孕激素总离子流图和选择离子流图（标品） 

图2 两种雌激素总离子流图和选择离子流图（奶粉样品）