使用ACQUITY UPLC H-Class系统进行肽段作图的可靠性

目标

测定ACQUITY UPLC® H-Class系统在长浅洗脱梯度应用中的分析可重现性，以解析复杂的混合物，例如肽图谱分析。 

ACQUITY UPLC H-Class系统提供了扩展批处理肽谱图分离的精确性和重现性。

背景

肽谱分析用于确认某种蛋白质的一级结构，识别翻译后修饰（PTM），并分析潜在的杂质。任何蛋白质结构差异应反映在含有该修饰的肽保留时间的变化中。含有和不含有特殊修饰的肽段的相对数量被用于测定含有该修饰的特定样品中的蛋白质的比例或含量。

面积比例的变化对应于含有特定修饰的样品中的蛋白分子的含量。为满足这些应用要求，需要采用长浅梯度洗脱。过去这些分离条件对于单泵梯度系统是一项挑战。本研究中，我们在ACQUITY UPLC H-Class系统上测试了一种典型的肽谱分析方案。

图1. 肽段作图样品列表开始于星期五，并在整个周末自动运行在星期一工作人员回到工作岗位时，数据已经准备好接受复查。图中显示了每三项分离，表现出了优异的重现性，分辨率和保留时间。如同表格1中的概括，五个做标记的峰，从A到E，被选为定量分析的代表。

溶液
ACQUITY UPLC H-Class系统由四元溶剂管理器（QSM），流量通过针头样品管理器（SM-FTN），柱加热器，以及光电二极管阵列（PDA）检测器。安装了可选择的250μL混合器。MassPREPTM BSA试剂中的标准肽段溶液经过ACQUITY UPLC BEH 300 C18反相柱分离。当每增加一个床体积的洗脱体积，洗脱梯度增加1.0%，每分钟梯度增加约为0.6%，此梯度被选为典型多肽作图梯度。

该方案充分利用了仪器的自动混合能力。纯溶剂储液器和浓缩修饰剂储备被用于替代二元，经预处理的溶剂。在本例中，梯度是在线路A中的纯水和线路B中的纯乙腈中形成，而一部分的液流从含有1%TFA的水储液器D中抽取。在梯度中，线路D的比例从5%降低到4%，相当于TFA浓度从0.05%降低到0.04%，从而使得基线漂移最小化。

肽谱图显示于图1，表格1中统计分析了保留时间和峰面积等参数。相对保留和分辨率在长系列运行期间保持恒定。保留时间是充分可重现的，以保证峰始终能被正确识别。以峰A的面积作为参比，比较峰B、C、D、和E，计算各测试样中其相应比例。在各测试样中这些面积比例均高度一致（如表格1），这样的精度符合我们在系列样品中测量修饰蛋白质的比例的要求。

表格1. 色谱峰保留时间和面积比例的总结。选作定量比较的5个峰，在整个洗脱梯度中均均匀间隔10min。

总结
对于有意义的肽段作图，同时需要定量和定性的可重现性。ACQUITY UPLC H-Class系统为大样品的肽段作图分离提供了精准的控制，使得分析师对仪器充满信心，相信任何保留时间的偏差均说明样品组成发生了变化，而不是由于仪器可变性引起的。在利用了这一多溶剂混合能力时，经观察的分离符合这一目标。这一系统的设计确保定量和定性结果均符合现代分析生物化学的要求.