在翻译后修饰和/或极碱肽的序列分析方面,电子转移裂解( ETD )线性离子阱质谱是很有优势的工具。传统的诱导活化裂解(CAD)常用来鉴定蛋白,并试图确定和找到他们修饰的位点,但这种技术有其本身固有的缺点,下面将详细叙述。与线性离子阱的结合使用的ETD是蛋白质组学研究的一个可靠的技术,可以很容易鉴定用CAD不能鉴定的多肽。ETD 是一个相对较新的肽/蛋白质碎裂的技术,能够大大推进质谱鉴定蛋白质这个领域的进步。
翻译后修饰
翻译后修饰(PTM)是翻译后的蛋白质进行的一种化学修饰,是蛋白质生物合成的后续步骤之一。蛋白的分析及其翻译后修饰的分析对于研究许多疾病是非常重要的,如癌症、糖尿病、心血管疾病和神经退行性疾病---阿尔茨海默病。这是因为在蛋白质的合成的过程中以及合成之后,可能发生各种蛋白修饰。对于正常细胞的功能,这些修饰是必须的,但调节这些修饰的变化可能会导致疾病的发生,如阿尔茨海默病,癌症和勃起功能障碍。蛋白质修饰可提高/降低蛋白质的活性,可以与其他蛋白质发生相互作用和将某一蛋白质定位到细胞的特定地方。
翻译后修饰,如磷酸化,乙酰化和甲基化被用作化学开关,激活/灭活组蛋白基因转录调控, DNA复制和DNA损伤修复。组蛋白是染色质的主要蛋白,DNA盘绕时,它们起到线轴的作用,而且在基因调控中发挥重要作用。因此,鉴定这种翻译后修饰是必需的,因为它在生物系统中对于某些蛋白的功能和作用至关重要。
用CAD鉴定蛋白
质谱在确定蛋白及其翻译后修饰上发挥了不可或缺的作用。CAD是一种常见的分析鉴定蛋白质的技术。一般用胰蛋白酶将蛋白质消化成较小的多肽,然后用反相色谱将其分离,并直接注入电喷雾质谱仪检测,通过串联质谱( MS / MS法)获得序列信息。通过电喷雾电离这些多肽形成几种带电状态的肽离子,而较低带电状态的最适合CAD分析。低能量的CAD串联质谱一直是最常用的分析方法,通过裂解肽离子进行后续的序列分析。
翻译后修饰分析,如磷酸化,磺酸化和糖基化很难用CAD进行分析,因为这些修饰通常是不稳定且容易丢失肽骨架的碎裂信息,从而导致很少或几乎不能得到肽序列和磷酸化位点。利用常规的CAD质谱对于含多个碱性残基多肽测序也是极为困难。
根据不同的蛋白质序列,有时胰蛋白酶会产生过小或过大的肽段。在这种情况下,缺乏可信的序列分析手段。因此CAD对短的,低带电的多肽是最有效的。对于鉴定蛋白和了解蛋白的生物学功能,这是一种广泛使用的方法,然而,限制了研究者分析了所有的肽段,这也阻止多个翻译后修饰位点的检测和了解这些蛋白的生物学功能。
先进的碎裂方式:ETD
ETD是基于离子/离子气相化学一种碎裂多肽的新方法。ETD通过从阴离子自由基到质子肽转移电子的化学能量将肽碎裂,这引起多肽骨干的分裂。 ETD产生的骨干肽序列和肽侧链的信息往往与CAD互补。
ETD已成功应用与线性离子阱以及其前身三维离子阱。虽然ETD在三维阱的执行价格具有竞争力且和CAD自身相比提供了独特好处 ,这样的组合并没有提供蛋白质组学分析所需的技术能力。非线性离子阱的ETD,它一直未能很好控制裂解过程,而且由于三维阱离子存储能力的有限不能处理大量的多肽。基于此,研究人员已经提出ETD功能应用于线性离子阱(Thermo Scientific LTQ XL mass spectrometer质谱仪) 。
相对于传统的CAD技术, ETD提供了更稳定的方法来定性PTMs,鉴定大型多肽或甚至整个蛋白质。 ETD能够将普通翻译后修饰的多肽,或者多个碱性残基的多肽甚至整个蛋白质生成离子。 ETD也可以轻易碎裂含有二硫键的的多肽。
ETD是为更复杂的FT-ICR仪器开发相似的裂解技术。使用电子转移试剂,而不是影响肽碎裂的自由电子使ETD在广泛使用的射频四极离子阱中得到应用。射频离子阱质谱仪具有低成本,低维护费用以及更易接受优点,相对于CAD碎裂方法,ETD碎裂技术能够产生更多的产物离子,利于肽段的解读。
ETD的线性离子阱提供了强有力的工具鉴定蛋白及其翻译后修饰 。LTQ XL线性离子阱质谱仪比其他任何离子阱提供更多的结构信息,ETD能够得到常规方法无法得到的序列信息。相比非线性离子阱,ETD的线性离子阱的显著特征在于离子和离子发生反应。虽然ETD功能是完全自动的且通常无需用户干预,但是当需要对离子数进行累积的时候,用户可通过软件完全控制线性离子阱的离子。线性离子阱质谱仪有能力处理大量的样品,并分析低浓度的大分子和小分子。与非线性离子阱的相比,该过程更为复杂和费时
应用实例
在最近的应用中,极碱的多肽和大量重要的翻译后修饰已经用含CAD和ETD线性离子阱质谱分析了。通常CAD碎裂方式产生的普通只显示有限的肽碎裂信息。然而,用ETD碎裂这些多肽的时候, 肽骨架碎裂信息能完全或几乎完全产生,因此得到更广泛的多肽序列的信息。
ETD的灵敏度和稳定性对于蛋白质组学分析是必不可少的。 ETD提供了高度可靠的解决方案,此方案具有用户友好性,几乎不需要日常维护,并提供高度准确的数据,而且ETD的数据分析有相应的软件支持,非常方便简单。
结论:
在蛋白质组学研究领域,ETD的应用对于研究疾病的机理,如癌症,药物开发研究以及细胞功能和信号转导有重大意义,ETD将扩大目前的分析,包括更多的碱性、非胰酶切肽段和蛋白质。它们能确定各种翻译后修饰以及鉴定新的蛋白亚型。
配备ETD的线性离子阱质谱可应用于蛋白质组学各个领域内。ETD的线性离子阱将继续推动蛋白质组学的发展,而且已被证明是替代CAD一种有效技术,而且ETD同样可以应用于非线性离子阱进行肽序列分析。在不久的将来,配备ETD的线性离子阱预计将成为碎裂技术的一种新选择。
参考文献
Leann M. Mikesh et al, The utility of ETD mass spectrometry in proteomic analysis, Biochemica et Biophysica Acta (2006), doi:10.1016/j.bbapap.2006.10.003
关于 Thermo Fisher Scientific (赛默飞世尔科技,原热电公司)
Thermo Fisher Scientific纽约证交所代码:TMO)是全球科学服务领域的领导者,致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。公司年销售额超过100亿美元,拥有员工约30000人,在全球范围内服务超过350000家客户。主要客户类型包括:医药和生物公司,医院和临床诊断实验室,大学、科研院所和政府机构,以及环境与工业过程控制装备制造商等。公司借助于ThermoScientific和FisherScientific这两个主要的品牌,帮助客户解决在分析化学领域从常规的测试到复杂的研发项目中所遇到的各种挑战。ThermoScientific能够为客户提供一整套包括高端分析仪器、实验室装备、软件、服务、耗材和试剂在内的实验室综合解决方案。FisherScientific为卫生保健,科学研究,以及安全和教育领域的客户提供一系列的实验室装备、化学药品以及其他用品和服务。赛默飞世尔科技将努力为客户提供最为便捷的采购方案,为科研的飞速发展不断地改进工艺技术,提升客户价值,帮助股东提高收益,
[来源:赛默飞世尔科技色谱质谱]
颠覆认知,“质”的飞跃 – Orbitrap Astral高分辨质谱仪年度论文汇总
2024.07.25
颠覆认知 “质”的飞跃 | 持续引领行业,赛默飞重磅新品发布
2024.07.25
颠覆认知 “质”的飞跃 | 持续引领行业,赛默飞重磅新品发布
2024.06.04
稳健之选,全程陪伴 —— 赛默飞发布Vanquish Access液相色谱新品
2024.05.10
2024.04.28
2024.04.28
版权与免责声明:
① 凡本网注明"来源:仪器信息网"的所有作品,版权均属于仪器信息网,未经本网授权不得转载、摘编或利用其它方式使用。已获本网授权的作品,应在授权范围内使用,并注明"来源:仪器信息网"。违者本网将追究相关法律责任。
② 本网凡注明"来源:xxx(非本网)"的作品,均转载自其它媒体,转载目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责,且不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。如其他媒体、网站或个人从本网下载使用,必须保留本网注明的"稿件来源",并自负版权等法律责任。
③ 如涉及作品内容、版权等问题,请在作品发表之日起两周内与本网联系,否则视为默认仪器信息网有权转载。
谢谢您的赞赏,您的鼓励是我前进的动力~
打赏失败了~
评论成功+4积分
评论成功,积分获取达到限制
投票成功~
投票失败了~