禾工发布三聚氰胺检测方法和整套仪器配置

固相萃取(SPE)方法介绍


1、固相萃取(SPE)柱的选择：
三聚氰胺呈弱碱性(弱阳离子化合物)，净化过程一般选择阳离子交换柱。混合型的阳离子交换柱(PCX)通过将磺酸基团(-SO3H)键合在极性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯（PEP）吸附剂上，具有阳离子和反相两种吸附机理，并具有以下优点：
1)、可通过两种不同溶液的洗涤(水/一定pH值的缓冲溶液和有机溶剂)，使样品更干净，提高检测的灵敏度。
2)、批次重复性好。
3)、回收率高，重现性好，即使小柱跑干也可以得到较高回收率。
五、HPLC-UV检测方法(GB/T……..)
一、 检测方法
1、试剂与材料：
除另有规定外，试剂为分析纯，水符合GB/T6682规定的三级水，色谱用水符合一级水的规定。
1.1 乙腈：色谱纯
1.2 甲醇：色谱纯
1.3 氨水：浓度25%～28%
1.4 混合型阳离子交换固相萃取小柱：60mg/3mL
1.5 三氯乙酸溶液10g/L ：称取10g三氯乙酸加水至1000mL。
1.6 乙腈水溶液：乙腈:水为50：50
1.7 盐酸溶液：0.1mol/L
1.8 氨水-甲醇溶液：量取5mL 氨水，溶解于100mL 甲醇中。
1.9 乙酸锌溶液219 g/L：取219g乙酸锌用300mL 水溶解后，定溶至1L。
1.10 20%甲醇溶液：200mL 甲醇，溶解于800mL 水中。混匀。
1.11 缓冲液：10mmol/L辛烷磺酸钠，10mmol/L柠檬酸，调pH3.0。
1.12 标准溶液：
1.12.1 标准贮备液1mg/mL ：称取100.0mg 与小烧杯中，加少量乙腈: 水40:60 溶解并转入100mL 容
量瓶中定容。
1.12.2 标准工作液10μg/mL ：准确吸取标准贮备液1mL 于100mL 容量瓶中，用乙腈: 水40:60定容。

2 仪器设备
实验室常用仪器及：
2.1 液相色谱仪
2.2 超声波振荡器


3 操作步骤
3.1 试样提取：
称取5g试样（精确到0.01g）与150mL 三角瓶中,加入50mL三氯乙酸溶液(1.5)或乙腈水溶液溶解
样品,放于超声波振荡器中超声萃取30min。取出加入5mL 乙酸锌溶液（1.9），前者采用三氯乙酸溶液
(1.5)、后者采用盐酸溶液（1.7）将试样转入100mL 容量瓶中定容至刻度，混匀后用滤纸过滤。

3.2 净化
分别用3mL 水，3mL 甲醇活化混合型阳离子交换固相萃取小柱后。取2mL 滤液上柱，然后分别用3mL 甲醇和3mL 水淋洗，将淋洗液全部抽干后，用3mL 氨水-甲醇（1.8）洗脱，洗脱液于50℃水浴中旋转蒸发至干。用20%甲醇溶液定容至1mL ，漩涡震荡1min，过0.45um滤膜过滤，上机测定。

3.3 测定
3.3.1 色谱条件
色谱柱：极性 C8柱(4.6mmi.d.×250mm,5μm)或C18柱（4.6mmi.d.×250mm,5um）；
流 速：1.0mL /min；
进样量：50μl；
柱 温：35℃；
波 长：240nm.
流动相：C8柱使用的为缓冲液（3.11）：乙腈=95:5；
C18柱使用的为缓冲液（3.11）：乙腈=90:10；
3.3.2 标准曲线绘制
分别吸取标准工作液（3.12.2）0.5、2.0、4.0、7.5、10.0mL于50mL 容量瓶中，用乙腈: 水40:60
分别定容混匀，该标准系列浓度分别为0.10、0.40、0.80、1.50、2.00μg/mL。将该标准系列溶液分别
注入仪器中，测定峰高（或峰面积）。以标准系列浓度为横坐标，峰高（或峰面积）为纵坐标绘制标准
曲线。或计算回归方程。

3.3.3 测定
分别吸取试液（3.2）注入仪器中，测定峰高（或峰面积）。由标准曲线查得试液中三聚氰胺的浓度或通过回归方程计算出试液中三聚氰胺的浓度。
4 结果表示
4.1 试样中三聚氰胺的含量X，以质量分数毫克每千克（mg/kg）表示


式中：
Cs—试液中三聚氰胺的浓度，（μg/mL ）；
V—试液体积，（100mL ）；
m—试样的质量，（g）；
n—稀释倍数；
6.2 平行测定结果用算术平均值表示，结果保留小数点后两位有效数字。



六、HPLC-DAD检测方法(GB/T……..)
（婴幼儿配方奶粉和牛奶中三聚氰胺的高效液相色谱筛选法）
一、检测方法
1、方法来源
本方法是在参考FCC三聚氰胺检测方法[Updated FCC Development MelamineQuantitation（HPLC—
UV），April2，2007]，FDA三聚氰胺检测方法 [GC-MS Screen for the Presence of Melamine ，(Adapted
from FDA/ORA Forensic Chemistry Center SOP T015) Revised April 10, 2007]的基础上，综合制定而成的
婴幼儿配方奶粉和牛奶中三聚氰胺高效液相色谱筛选方法。
2、试剂
1.1 磺基水杨酸：分析纯；
1.2 柠檬酸：分析纯；
1.3 辛烷磺酸钠：高效液相色谱离子对试剂；
1.4 乙腈：色谱纯；
1.5 盐酸：分析纯；
1.6 超纯水：18.2MΩ；
1.7 60g/L磺基水杨酸：称取60g磺基水杨酸用水定容至1L；
1.8 0.1N HCl：量取8.3mL盐酸用水稀释至1L；
1.9 标准储备液：精密称取三聚氰胺0.0100g，用甲醇配制成浓度为1mg/mL 标准储备液。
2.0 标准使用液：将标准储备液用甲醇逐级稀释至适宜浓度。
3、仪器
高效液相色谱，附二极管阵列检测器
4、样品处理
2.1 配方奶粉：称取0.5g样品，加入0.1N HCl约15mL，涡旋混匀，超声提取30min后加入60g/L磺基
水杨酸3~4mL，用0.1N HCl定容至25mL，混匀后离心，上清液经0.45μm的微孔滤膜过滤后进样。
2.2 牛奶：称取15g左右样品，加入60g/L磺基水杨酸3~4mL，用0.1N HCl 定容至25mL，混匀后离心，
上清液经0.45μm的微孔滤膜过滤后进样。
5、参考色谱条件
4.1 色谱柱：ODS C8，250mm×4.6mm
4.2 流动相：缓冲液：乙腈=85：15，等度洗脱
4.3 缓冲液：10mM柠檬酸+10mM辛烷磺酸钠，调pH为3.0
4.4 流 速：1.0mL/min
4.5 柱 温：40 ℃
4.6 波 长：240nm


6 计算公式 


式中：X—样品中三聚氰胺含量，mg/kg；
C—从标准曲线上查出的含量，μg/mL；
V—定容体积，mL；
M—称样量，g

7 定量限
本方法的定量限为1mg/kg

8 参考色谱图和光谱图 





高效液相色谱仪三聚氰胺检测配置
1） STI 5000型液相色谱仪系统
1 P5000 型高压恒流输液泵 1台
2 UV5000紫外检测器 1台
3 Rheohyne 7725i 手动进样阀 1支
4 三聚氰胺分析专用液相色谱柱 1支 
5 25/50ul微量注射器 1支
6 N2000色谱工作站（SP1版） 1套
7 液相启动工具包 1套
2) 液相附助设备
1 KQ-2200　超声波清洗器 3L 1台 
2 HP-01袖珍式真空泵 0.80MP 1台
3 FB-10T溶剂过滤器 1000mL 1台
4 HG-330色谱柱温箱 室温-100℃ / 0.1℃ 1台 
6 有机过滤膜 φ50×0.45mm 1盒
7 水系过滤膜 φ50×0.45mm 1盒 
8 有机针式过滤器 φ13×0.45mm 1盒
9 水系针式过滤器 φ13×0.45mm 1盒
10 RO DI反渗透超纯水机 15L/H　 1台




VERTEX系列液相色谱仪主要指标
一、P5000高压恒流输液泵
技术指标 产品说明
等度泵
流速精度：0.1%
流速范围：0.001～10ml/min/0.001ml增量
最高耐压：6000psi（0～10ml/min）
压力脉冲：<1% 特点说明
双柱塞串联式往复泵,自动脉冲抑制系统
输液泵开机自检，自动判断故障
泵头各部件单独设计，便于拆装维护
内置高低压报警和保护功能
多种泵头选择：微量泵、分析泵、半制备/制备泵
自动检测泵头类型，智能修正参数设置
程序化溶剂压缩因子，能自动补偿流量
梯度由内部软件实现自动控制，可编辑、存贮60个梯度方法，能运行复杂的梯度程序
可以通过外部接点闭合控制。
独特优点：
独特的柱塞杆自动清洗装置，使P5000系列高压输液泵不需要花钱购买在线清洗装置，也无须担心盐类晶体的析出对柱塞杆造成损伤；
专利设计的“浮动式泵柱塞杆密封圈”技术，可设定溶剂相应的压缩因子，泵头可以自动排空，无须手动排空即可输液；可延长密封圈使用寿命；
P5000型输液泵使用的“自吸式单向阀”，是世界上最好的单向阀，阀球能在溶剂通过单向阀后回流之前回到阀座将之密封，保障了泵流量超常的稳定。
优秀的单向阀设计与先进的“浮动式泵柱塞杆密封圈”技术，使P5000输液泵在0-10ml/min的流量范围内都能耐压6000Psi，且压力波动远小于10Psi，成为国内外压力波动最小的泵之一。
拥有用户至关重要的两大功能
①自动排空 ②自动清洗
二元梯度泵
流速精度：0.1%
流速范围：0.001～10ml/min（等度），
0.001～10ml/min（梯度）/0.001ml增量
延迟体积：<150uL
最高耐压：6000psi（0-10ml/min）
压力脉冲：<1%
比例精度：±0.2%, 2ml/min
四元梯度泵
流速精度：0.1%
流速范围：0.001～10ml/min，0.001ml增量
延迟体积：<400uL
最高耐压：6000psi（具高低压保护功能）
压力脉冲：<1%
外置4流路在线真空脱气机
制备泵
流速精度：0.1%
流速范围：0.2～80ml/min（等度），
0.2～100ml/min（梯度），0.001ml增量
延迟体积：<150uL
压力脉冲：<1.5%
比例精度：±0.2%, 5ml/min

自吸式单向阀-世界上最为优秀的单向阀
高压输液泵所使用的ASI自吸式单向阀是目前世界上最好的单向阀，它产生的流量有非常好的可重复性与准确性，这意味着单向阀能保持非常好的重复性。下图是Waters公司的单向阀与ASI公司的单向阀的使用比较，显而易见，ASI的自吸式单向阀的性能效果要优于Waters的单向阀。（Data Certified by: Baseline Services, Mercerville, NJ May 21, 1997, Bodman Chromatography Aston, PA May 21, 1997）