人血浆甲氨蝶呤的浓度HPLC检测法

甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）是二氢叶酸还原酶抑制剂，是通过抑制细胞内二氢叶酸酶达到杀灭肿瘤细胞的作用。目前临床采用大剂量甲氨蝶呤配合亚叶酸钙解救（HD-MTX+CF）治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）。有研究表明，ALL患者MTX血药浓度与不良反应和疗效之间存在密切关系且个体差异大。

为了安全有效地实施HD-MTX给药，监测MTX用药后的血药浓度尤为必要，以确保临床用药安全有效。目前测定MTX血药浓度的方法有荧光偏振免疫分析法、高效液相色谱法（HPLC）、LC-MS法等。荧光偏振免疫分析法成本昂贵，且专一性差，难以推广，而且由于代谢产物的存在抗体可能交叉反应使测定结果偏高。国外采用LC-MS法测定MTX血药浓度虽专一性较强且灵敏度高，但此方法费用高，操作复杂。而HPLC具有专属性高、灵敏、准确、适用性强等优点，更适合广泛应用。

        检测仪器：高效液相色谱仪（色谱工作站，SPDiOA—VP紫外检测器）；旋涡混合器；台式离心机。

色谱条件：色谱柱柱温为35℃；检测波长为303nm：流动相为乙腈-0．16mol/L乙酸钠水溶液（12∶88）；流速1ml/min。

测定方法

对照品溶液制备：精密称取MTX对照品1．5mg置50ml容量瓶中加甲醇溶解并定容至刻度，得30．0μg/ml的对照品储存液，置于4℃冰箱保存。使用时精密吸取适量对照品储存液加人血浆稀释至所需浓度。

血浆样品预处理：取样品血浆200μl，置于1．5mlEP塑料管中，加入50μl6％高氯酸液，沉淀血浆中的蛋白质，旋涡振摇2min，于4000r/min离心5min。

取20μl上清液进样，记录色谱图。