植物组织DNA的提取制备及应用

一、实验原理

植物DNA的制备与动物DNA制备原理大致相同，为获得高相对分子质量DNA，应取幼嫩组织或组织培养物为材料，常以液氮冷冻下研磨的方法破组织和细胞。

由于植物材料DNase水平低，蛋白含量较少，其操作要求是要克服植物次生代谢物如多酚、类黄酮和植物多糖与DNA共存对制备的影响。

二、实验用品

  （一）器材

（1）冰冻高速离心机。

（2）液氮罐。

（3）台式离心机。

（4）电热恒温水浴锅。

（5）电热恒温培养箱。

（6）电冰箱，离心管和tip。

（二）试剂  

（1）5mol/L Nacl：称取NaCL 146.10g用蒸馏水定容至500ml。

（2）CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)缓冲液。

      A.2mol/L Tris^.HCL缓冲液（pH8.0）：24.2g Tris溶于80ml重蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.0，用重蒸水定容至100ml。

      B.0.5mol/L EDTA缓冲液（PH8.0）：取186.12g EDTA.Na2用重蒸水800ml溶解，然后用NaOH调节pH至8.0，加重蒸水至1000ml。

（3）巯基乙醇。

（4）PVP(聚乙稀吡咯烷酮)。

（5）石英砂。

（6）氯仿：异戊醇（24：1），现用现配。

（7）异丙醇。

（8）75%乙醇。

（9）TE缓冲液：取5ml 2mol/L Tris-HCL和2ml0.5mol/L EDT^.Na₂。用重蒸水定容至1000ml。

（10）RNase A：取100mg RNase溶于10ml含有10mmol/L Tris(pH7.5)-15mmol/L Nacl 的溶液中，于100℃加热15min,缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。

（三）材料

    水稻幼苗或蚕豆幼苗和白菜嫩叶等。

二、实验程序

（一）操作方法

 1.操作步聚

 （1）在50ml离心管中加入10ml CTAB缓冲液。

 （2）取1~2g新鲜叶片（去主脉）于研钵中，加入0.1gPVP或石英砂，在液氮中迅速研磨成粉末后，把粉末转入带CTAB缓冲液的离心管中，边加边搅拌使之混合均匀。

（3）于65℃水浴保温0.5~1h。

（4）冷却至室温后，加入等体积10mlTrichloromethane异戊醇溶液，颠倒混匀10min。

（5）10000 r/min离心10min，去沉淀，将上清液转入另一离心管中。

（6）在上清液中加入1/10体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积的异丙醇 10ml或2倍体积乙醇，轻缓颠倒混合均匀，于-20℃放置30min。

（7）10000 r/min 4℃离心10min，去上清液。

（8）用2ml75%乙醇洗涤2次去除盐（可放置-20℃冰箱过液）。

（9）倒去75%乙醇，37℃干燥20分钟，再溶于600µL TE缓冲液中，转移至1.5ml EP管。

(10)加入3µL RNase A ，37℃保温30min。

（11）用等体积Trichloromethane异戊醇溶液抽提1~3次。

（12）10000r/min,4℃离心10min，吸取上清。

（13）上清液加入1/10体积4mol/L NaCL溶液后，加入2倍体积无水乙醇，放置20min后，10000r/min,离心5min沉淀DNA。

（14）沉淀用75%乙醇乙洗涤2~3次，37℃保温箱中干燥后溶于适量的TE缓冲液中备用。

2得率的计算

由于1OD₂₆₀的DNA浓度为50µg/ml，因此DNA得率可按下公式计算：

1g新鲜组织的DNA含量=OD₂₆₀×50×溶解体积/组织鲜重（µg DNA/g）。