膜磷脂的分析

一、实验原理

 膜中脂类的主要组分是磷脂和胆固醇，磷脂为含磷酸与氨碱的单脂衍生物，可分甘油磷脂及鞘氨醇磷脂两类，它们在生命活动中有重要作用。

用甲醇-Trichloromethane可将生物膜中的脂类组分提取出来。

二、实验用品

  （一）器材

 （1）具塞试管。

 （2）普通离心机。

 （3）15cm×15cm玻璃板。

 （4）薄层层析展层缸。

 （5）定磷用的全套器材。

   （二）试剂  

（1）硅胶H-碱式碳酸镁混合物：称取97g薄层层析用硅胶H，3g碱式碳酸镁置研钵中研磨，并混合均匀。

（2）硅胶H-碱性硅酸镁混合物：称取98g薄层层析用硅胶H，2g碱性硅酸镁置研钵中研磨，并混合均匀。

（3）称取磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，神经鞘磷脂，卵磷脂等各5mg，溶于10mlTrichloromethane:甲醇中。

     （4）有机溶剂氯仿、甲醇、乙酸。

     （5）氨水。

     （6）碘。

     （7）高氯酸。

     （8）定磷试剂。

（三）材料

     红细胞膜。

三、实验程序

   1.膜脂类的提取

     将冰冻干燥的膜制品总重量的一半悬浮于0.8ml等渗的磷酸盐缓冲液中，加3ml Trichloromethane:甲醇，盖上试管塞，剧烈振荡最少1min，另外，再加1mlTrichloromethane振荡1min,最后加1ml水振荡1min。用台式离心机低速离心5min,在离心管里分相，缓缓地吸去上相，用细头滴管穿过两相界面处变性蛋白的薄层，吸出下相液，转移到一个已知重量的小烧杯内，置真空干燥器内，用水泵抽气，使溶液蒸发至干。称重。记录脂类抽提物的重量。

2.磷脂的分析

(1)硅胶板的规格及制作方法：准备几块15cm×15cm的玻璃板，洗净。烘干或滴上几滴乙醇，用清洁的纱布擦干。

   取3g硅胶H-碱式碳酸镁混合物或硅胶H-碱性硅酸镁混合物，置于水平台面上，使其自然干燥，然后放在110℃烘箱内活化30min,贮于真空干燥器内备用。

(2)点样：用200µLTrichloromethane-甲醇溶解2mg干燥的脂类。取100µL溶解的样品溶液，点在距板的边缘约2cm处薄层板的一个角上，点样的面积要小，待样品干燥后再点一次，如此重复。

另取一块薄层板 ，依同样位置点上磷脂的标准样品混合液。

(3)展层：采用倾斜上行法展层。展层缸内新配制的溶剂系统平衡，进行双相层析。

每相展层约需2h，当溶剂前沿距板的顶端2~3cm时，取出薄层板，用铅笔画出溶剂前沿位置，干燥。第一相展层后，取出，在空气中干燥约15min，若空气湿度太大时，则须在放有硫酸干燥哭喊内干燥0.5h。

(4)显色及定位：将干燥后的薄层板放入碘缸内，盖好。升华的碘与磷脂发生加成反应，而使磷脂的斑点呈现黄色或棕色。

斑点显现后，参考磷脂标准样品的相对位置及Rf值鉴别红细胞膜中含有那几种磷脂。