2016/07/13 16:45
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产品配置单:
来亨L-806固液萃取仪全自动脂肪测定仪
型号: L-806
产地: 北京
品牌: 来亨
¥5万 - 10万
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来亨L-805A全自动凯氏定氮仪
型号: L-805A
产地: 北京
品牌: 来亨
¥5万 - 10万
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L-807自控粗纤维测定仪
型号: L-807
产地: 北京
品牌: 来亨
¥5万 - 10万
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方案详情:
Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质含量
一、实验原理
蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH),因此有双缩脲反应,在碱性溶液中,能与CU2+ 形成络合物。Folin-酚试剂反应是在双缩脲反应的基础上,引进Folin试剂(磷钼酸-钨酸试剂),蛋白质-铜络合物能还原磷钼酸-磷钨酸试剂,生成蓝色物质。在一定条件下,蓝色强度与蛋白质的量成正比例。
本法的优点是操作简便、灵敏度高、较此外吸收法灵敏10~20倍,较双缩脲法灵敏100倍,反应约在15min内有最大显色,并至少可稳定几小时。其不足之处是此反应受多种因素干扰。对双缩脲反应发生干扰的基团,Tris.HCL缓冲剂以及蔗糖、硫酸铵、巯基化合物,酚类及柠檬酸,均对此反应有干扰作用。在测试时应排队干扰因素或做空白实验消除。含硫酸铵的溶液只需加浓Na2CO3-NaOH溶液即可显色测定。若样品酸度较高,显色后色浅,则必须将Na2CO3-NaOH溶液的浓度提高1~2倍。
本法可测定范围是25~250μg蛋白质。
二、实验用品
(一)器材
(1)722型分光光度计。
(2)恒温水浴锅。
(3)试管及试管架。
(4)0.5ml,1ml及5ml移液管
(二)试剂
(1)试剂甲。
(A)4%Na2CO3溶液;
(B)0.2mol/LNaOH溶液;
(C)2%酒石酸钾钠溶液(或酒石酸钾、酒石酸钠);
(D)1% CuSO4.5H2O溶液;
临用前将(A):(B):(C):(D)=50:50:1:1(体积比)混合,此混合液即为试剂甲。混合后的溶液1d内有效。
(2) Folin-酚试剂(试剂乙):在1.5L容积的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4.2H2O),25g钼酸钠((Na2MoO4.2H2O),及700ml蒸馏水,50ml 85%磷酸,100ml浓盐酸充分混合,烧瓶内加小玻璃珠数颗,以防溶液溢出,接上回流冷凝管以文火回流10h。回流结束后,加入150g硫酸锂(LiSO4),50m重蒸水及数滴液溴,开口继续沸腾15min,以除去多余的溴。冷却后溶液呈金黄色(如果仍呈绿色,须再重复滴加溴水的步骤),定容至1L,过滤,滤液置棕色瓶中保存,可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久,颜色由黄变绿,可加几滴液溴,煮沸数分钟,恢复原色仍可继续使用。使用时用标准NaOH滴定酸度,以酚酞为指示剂。该试剂的酸度应为2mol/L左右,将之稀释至相当于1mol/L酸度使用,即为Folin-酚试剂。
(3)标准蛋白质溶液:可用结晶牛血清蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量,再根据其纯度配制成500μg蛋白/ml溶液。
(三)材料
血清使用前稀释100倍或约含20~250μg蛋白/ml溶液。
三、实验程序
(一)操作方法
1.蛋白浓度标准曲线制作
取14支试管,分两组按表9-1平行操作。
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