使用 Agilent Captiva EMR-Lipid 和 LC-MS/MS 对人血浆中的 THC 和代谢物进行高效定量分析

摘要

复杂生物样品的高效提取、净化和分析对法医学实验室极为有益。磷脂 (PPL) 已被确定为血浆的 LC-MS/MS 分析中引起基质效应的主要来源。本应用简报介绍了血浆样品前处理以及血浆中四氢大麻酚（Δ⁹-THC 或 THC）及其主要代谢物 11-羟基-Δ⁹-THC (THC-OH) 和 11-nor-9-羧基-Δ⁹-THC (THC-COOH) 的 LC-MS/MS 分析。样品前处理时采用孔内蛋白质沉淀法 (PPT) 和 Agilent Captiva EMR-Lipid 1 mL 过滤柱直通净化去除 PPL。Captiva EMR-Lipid 过滤柱能够得到更洁净的洗脱液，去除血浆基质中 99% 以上不需要的 PPL，目标分析物的回收率高于 90%，RSD 小于 10%。对 1 ng/mL THC、THC-OH 和 THC-COOH 的分析得到了理想的峰形，并获得了良好的信噪比 (S/N)。在 0.5–100 ng/mL 范围内获得的响应呈线性，R² 高于 0.99。血浆中的定量限 (LOQ) 为 1.0 ng/g 或更低。在 3 天的实验过程中，得到的结果一致。

前言

在法医学实验室的日常样品分析中，LC-MS/MS 分析之前高效的样品前处理是一个重要考虑因素。样品前处理可用于减少系统污染并改善数据完整性、方法选择性和分析灵敏度。血浆中存在的两种主要干扰物质为蛋白质和磷脂 (PPL)。PPL 已被确定为 LC-MS/MS 生物分析中引起基质效应的主要来源，因为在电喷雾电离 (ESI) 期间所形成的液滴表面上会发生竞争电离。蛋白质易于通过简单的样品前处理方法（如蛋白质沉淀(PPT)）去除，但 PPL 则难以得到有效去除。

法医学实验室中常用的样品前处理技术包括 PPT、固相萃取 (SPE)、液液萃取 (LLE) 和介质液液萃取 (SLE)。每种技术在速度、成本和生成数据的质量方面各有优劣。例如，PPT、LLE 和 SLE 无法去除 PPL，而 SPE 执行起来更耗时且更复杂。然而，在这些技术中，PPT 得到了最广泛的认可。PPT 以规定的比例向生物样品中加入有机沉淀溶剂（如乙腈 (ACN) 或甲醇 (MeOH)），可轻松去除蛋白质。随着蛋白质的变性，它们形成的沉淀可通过过滤或离心得以去除。PPL 无法通过 PPT 去除，因为这种物质溶于有机沉淀溶剂中，在过滤或离心后仍保留在样品中。

大麻类物质是支持案件调查的法医学实验室中最常见的目标分析物之一。快速、准确地确认并定量生物样品中的 Δ⁹-THC (THC) 及其主要代谢物 11-羟基-Δ⁹-THC (THC-OH) 和 11-nor- 9-Δ⁹-羧基-THC (THC-COOH) 至关重要。然而，THC 及其代谢物在样品前处理过程中容易发生非特异性结合。

迫切需要一种样品前处理方法，在减少样品前处理步骤（包括离线 PPT、离心、转移和稀释）的同时实现高效蛋白质和PPL 去除，并使目标分析物获得令人满意的回收率。本应用简报介绍了一种在 PPT 之后使用 Agilent Captiva EMR-Lipid 去除 PPL 的方法，该方法通过简单的直通净化步骤即可完成，不会引起分析物损失。所得的提取物更洁净，减少了潜在的离子抑制以及色谱柱和质谱仪污染。

依次使用孔内 PPT 和 Captiva EMR-Lipid 1 mL 过滤柱去除 PPL，对血浆中的 THC、THC-OH 和 THC-COOH 进行萃取。随后使用 Agilent 6490 三重四极杆液质联用系统进行定量分析。对 EMR-Lipid 过滤柱净化去除 PPL 的效率进行了评估。还测定了 THC 及其代谢物的日间（3 日）准确度、精密度和回收率。

有关全血样品的分析，请参见安捷伦应用简报使用 Captiva EMR-Lipid 和 LC-MS/MS 对全血中的 THC 及其代谢物进行高效定量分析。

结论

本应用简报介绍了一种简便而快速的血浆样品前处理工作流程，用于对 THC 及其代谢物进行法医学研究的 LC-MS/MS 分析。依次采用孔内 PPT 和 Agilent Captiva EMR-Lipid 1 mL 过滤柱净化来提取血浆中的目标分析物。Captiva EMR-Lipid 能够去除血浆基质中 99% 以上的 PPL，并使目标分析物获得优异的回收率。样品提取物比单独使用 PPT 获得的提取物更洁净，从而减小了基质离子抑制作用，并改善了分析准确度、精密度和重现性。更洁净的提取物还减少了对 LC-MS/MS 系统的污染以及可能由维护带来的停机时间。孔内 PPT 具有减少样品处理和转移的优点。

对 1 ng/mL THC、THC-OH 和 THC-COOH 的分析得到了理想的峰形和良好的 S/N，该浓度低于确定损伤所需的 5 ng/mL 浓度。血浆中处于 0.5–100 ng/mL 范围内的校准曲线呈线性，其中 R² 高于 0.99。获得的三种分析物的 LOQ 为 1.0 ng/g或更低，RSD 小于 10%。回收率高达 90% 或更高。在 3 天的重复分析过程中，结果保持一致。

Captiva EMR-Lipid 方法可轻松融入现有工作流程中，无需额外的样品前处理装置或玻璃器皿。在 96 孔板或 1 mL 过滤柱形式中，Captiva EMR-Lipid 可兼容自动化系统，适用于高通量应用。滤芯设计可轻松高效洗脱样品，不易发生堵塞。