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基于 Orbitrap Fusion Lumos 平台的简单快速抗体药物天冬氨酸异构化解析

2018/01/29 14:13

阅读:1314

分享:
应用领域:
制药/生物制药
发布时间:
2018/01/29
检测样品:
治疗类生物药品
检测项目:
含量测定
浏览次数:
1314
下载次数:
参考标准:
天冬氨酸异构化

方案摘要:

建立了天冬氨酸异构化质谱解析方法,为单抗药物的准确、快速、精细解析提供了可靠的分析手段,尤其当一些药物质控分析中出现异常电荷异质性或药物异常降解时,可以进行肽图水平的精确质谱分析。

产品配置单:

分析仪器

赛默飞Trace1300E 气相色谱仪

型号: Trace1300 E

产地: 意大利

品牌: 赛默飞

¥30万 - 50万

参考报价

联系电话

方案详情:

    进入临床实验和正在研发的单抗药物日趋增加,对于单抗药物的安全性和有效性评价的测试也越发重要。与小分子药物相比,单抗药物更易在生产、运输和储存的过程中,发生各种翻译后修饰的变化,比如单抗中甲硫氨酸和酪氨酸氧化,天冬酰胺脱酰胺化,天冬氨酸异构化等都会影响药物分子的稳定性,同时影响蛋白的结构和功能。因此,对各种翻译后修饰的质控分析也提出了更高要求。目前使用 LC-MS/MS 在线分析质谱技术,在常规的肽图分析中,可以同时对多种翻译后修饰进行定性和定量分析,比如甲硫氨酸氧化、N 糖基化、天冬酰胺脱酰胺化,但对于天冬氨酸异构化我们关注的都比较少,本文我们为大家提供更加完整的天冬氨酸异构化解决方案,有助于单抗药物的精细质控分析。
    天冬氨酸(D)异构化是一种自发性的非酶翻译后修饰,发生异构化后的天冬氨酸(isoAsp),在蛋白骨架中插入了一个亚甲基,也就是同时天冬氨酸侧链减少了一个亚甲基,如图 1 所示,因此引起蛋白结构的变化,从而引起蛋白功能的变化。抗体 CDR 区域中天冬氨酸异构化已被证实会降低受体结合效率,影响最终的药效。位于铰链结构区域,或者位于 DG/DS(G为甘氨酸,S为丝氨酸)区域的天冬氨酸易发生异构化。同时在弱酸性溶液中,会增加天冬氨酸异构化的水平。在天冬酰胺(N)发生脱酰胺化时,会伴随带来天冬氨酸异构化,并且异构化的水平和非异构化的水平基本在 3:1 的比例,一般包含 NG 区域和 PENNY(P为脯氨酸,E为谷氨酸,Y 为酪氨酸)区域的天冬酰胺易发生脱酰胺化,并带来天冬氨酸异构化。由于异构化本身不会引起分子量和电荷的变化,因此大大增加分析的难度。在完整蛋白的水平上,可以使用离子交换和亲和色谱进行天冬氨酸异构化分析,不过对于低丰度的异构化水平就无法准确确定,因此,我们需要在肽段水平上进行天冬氨酸异构化的分析,当使用反相色谱(RP)进行分析时,一般异构化的肽段会优先于未异构化的肽段被洗脱下来,不过在受到柱子填料和流动相添加离子对试剂等因素影响时,同样会出现晚于未异构化肽段流出的现象。目前,在常用的碰撞诱导激活解离(CID)和高能碎裂(HCD)进行二级碎裂时,无法通过碎片离子进行天冬氨酸异构化的确认。ETD作为一种补充碎裂方式,尤其在进行长肽段,翻译后修饰肽段和完整蛋白水平分析时,可以提供与 CID/HCD 互补以及 ETD 特征性的碎片离子,从而准确的确定氨基酸序列以及翻译后修饰位点的信息。本篇中使用电子转移解离(ETD)时,包含天冬氨酸异构化的碎片会产生相应的特征质量增加,如图2所示,因此可以准确的判断天冬氨酸异构化的位点。

    本文基于最新的三合一超高分辨质谱Orbitrap Fusion Lumos分析平台,采用ETD碎裂方式,建立了天冬氨酸异构化质谱解析方法,为单抗药物的准确、快速、精细解析提供了可靠的分析手段,尤其当一些药物质控分析中出现异常电荷异质性或药物异常降解时,可以进行肽图水平的精确质谱分析。

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