pBM27 Toposmart Cloning Kit（gateway系统入门 TOPO克隆载体）

pBM27 Toposmart Cloning Kit（gateway系统入门 TOPO克隆载体）

商品属性：

 产品介绍：

保存条件：-20℃保存
产品介绍：

利用痘苗病毒的拓扑异构酶I(Topoisomerase I)的切割再连接的特点将PCR产物定向克隆到线性化的pBM27载体中。适用于克隆由Pfu、sPfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶扩增的平末端PCR产物。pBM27载体类似于invitrogen公司的pENTR/D-TOPO入门载体，具有attL1和attL2，为gateway系统中的入门载体。引物M13F(-21)和M13R可用于菌落PCR和测序鉴定。

产品特点：

（1）连接反应仅需 5 分钟。
（2）只适合平末端 PCR 产物的快速、高效、定向克隆。
（3）载体采用了新的制备工艺，零背景，无需蓝白斑筛选
（4）可在基因的 C 端中融合 Flag 标签序列。
（5）载体为壮观霉素抗性。

注意事项：

(1) 引物要求：PCR 引物 5’端不能进行磷酸化修饰，普通商业化引物即可。上游引物的 5’端添加 CACC 四个碱基（CACC 为真核表达所必需的 Kozak 序列）。如果目的蛋白需要在 C 端带 FLAG 标签，下游引物则需要去掉基因本身的终止密码子（3 个碱基），目的蛋白的翻译终止由 FLAG 标签的终止密码子 TAA（位于 Xho I 酶切位点前）来实现。
(2) DNA 聚合酶：选用 Pfu、sPfu、Phusion、Q5、KOD 和 Xerox 等高保真 DNA 聚合酶用于 PCR 扩增。
(3)连接时间：5-15 分钟，一般为 15 分钟。
(4)连接温度：室温 (22℃-37℃)，可使用PCR仪控温。最佳反应温度为25℃。若片段有高GC等复杂结构，可在37℃反应。
(5)产物要求：为保证PCR产物完整，建议72℃后延伸5-10分钟。连接前使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的质量和纯度，如PCR产物为非单一性条带，目的片段一定要切胶回收。如PCR产物为单一条带，无引物二聚体，可以取1-3?l的PCR产物直接连接。但若扩增模板为质粒DNA，应注意质粒的抗性。由于pBM27载体为壮观霉素抗性，以壮观霉素抗性的模板质粒扩增的PCR产物应切胶回收后再连接。
(6)片段用量：胶回收的DNA片段一般使用量为50-100ng。对照片段为5’端带CACC四个碱基的全长EGFP基因的平末端产物。
(7)往M13F(-21)和M13R引物干粉管加120?l灭菌水即为5?M浓度的引物。 

pcr相关试剂实验结果分析：

PCR实验结果的分析涉及多个方面，‌包括实验操作、‌试剂质量、‌实验条件等，‌这些因素都会影响PCR实验的成功率和结果的准确性。‌以下是对PCR实验结果分析的一些关键点：‌

循环次数过多：‌增加模板量减少循环次数，‌缩短退火时间及延伸时间，‌或改用两种温度的PCR循环，‌可以有效避免循环次数过多导致的问题。‌

退火温度过低：‌退火温度的适当调整对于PCR反应的成功至关重要，‌过低的退火温度可能导致非特异性扩增，‌影响结果的准确性1。‌

电泳体系问题：‌包括凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大、‌凝胶没有凝固好、‌琼脂糖质量差等问题，‌这些都会影响DNA片段的分离效果。‌

试剂盒问题：‌运输储存不当可能引起试剂盒失效，‌试剂盒本身质量问题如引物选择、‌循环参数设置不当也可能导致实验失败1。‌

降解的陈旧模板：‌使用降解的陈旧模板进行扩增容易产生涂布，‌影响结果的解读1。‌

PCR假阴性结果：‌可能由引物长度不够、‌试剂浓度不标准、‌靶序列突变或缺失、‌循环参数设置错误、‌标本中有Taq酶抑制剂、‌PCR产物检测系统灵敏度不够等因素引起。‌

为了获得准确的PCR实验结果，‌需要注意以下几点：‌

确保PCR反应体系中各种试剂的配比和操作步骤的精准度。‌

在PCR反应过程中需要对PCR产物进行实时监测，‌以便及时对反应条件进行调整。‌

防止样本的污染和交叉感染，‌以免影响PCR反应的准确性和可靠性。‌

通过上述分析，‌可以更好地理解和控制PCR实验中的关键因素，‌从而提高实验结果的准确性和可靠性。‌

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