产品描述

Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit是新一代的同源重组克隆试剂盒，精心优化的2×Hieff Clone® Universal Enzyme Premix预混了重组酶和重组反应所需缓冲液，并添加了独特的重组增强因子，可显著提高重组克隆效率。

该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任何载体的任何位点，浓度可低至5 ng/μL，一次可实现多至6个片段的顺序拼接克隆。将载体线性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下，仅需50℃，5-15 min即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。

产品组分

产品应用

快速克隆；定向克隆；定点突变。

运输与保存方式

冰袋运输。-20℃保存，有效期1年。

注意事项

1. 需自备的材料：

1）自备样品：自备好线性化载体和插入片段。

2）自备试剂（仅罗列部分）：

① 超级感受态：转化效率＞108 cfu/μg，如翌圣DH5α超级感受态细胞（Cat#11802）；

② 高保真酶： 2×Hieff Canace® Gold PCR Master Mix（Cat#10149）或其他等效产品；

③ 菌落PCR mix：2×Hieff® Robust PCR Master Mix（With Dye)（Cat#10106）或其他等效产品；

④ 核酸染料：YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000 × in Water)（Cat#10202）或其他等效产品；

3）自备仪器耗材（仅罗列部分）：PCR仪，水平电泳槽，切胶仪，EP管等；

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 本产品仅作科研用途！

简版操作步骤

一、重组反应

1.线性化载体与插入片段使用量

Hieff Clone® 重组反应体系最适片段及载体插入总量为0.02-1 pmol，1-3片段为0.02-0.5 pmol，4-6片段为0.5-1 pmol。最适载体与插入片段摩尔比为1:3。对应的DNA质量可由以下公式计算获得：

线性化载体使用量ng =（线性化载体碱基对数×0.65×总pmol）/ （1＋3n）

插入片段使用量ng =（插入片段碱基对数×0.65×总pmol×3）/ （1＋3n）
其中n表示插入片段数目。

线性化载体使用体积 = 线性化载体使用量ng / 线性化载体浓度ng/μL

插入片段使用体积 = 插入片段使用量ng /插入片段浓度ng/μL

【注】：当插入片段长度大于载体时，最适载体与插入片段使用量的计算方式应互换，即插入片段当做载体，载体当做插入片段进行计算。线性化载体及插入片段的使用量最低可达到5 ng。线性化载体和插入片段扩增产物未纯化，直接使用时，使用总体积应不超过反应体系体积的1/5，如20 μL体系不超过4 μL。

2.重组反应体系（推荐冰上配制，各组分使用前需混匀）

3.重组反应条件

1）体系配制完成后，用移液器轻轻吸打混匀各组分，短暂离心将反应液收集至管底。

2）当插入1个片段并且DNA总量＜300 ng时，反应条件为50℃，5 min；当插入片段数为2-6个时，建议反应条件为50℃，15-60 min（反应时间随片段数增多而延长）。建议在PCR仪或金属浴等温控精确的仪器上进行反应。

3）反应产物可直接进行转化，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。

二. 重组产物转化、涂板

1）在冰上解冻克隆感受态细胞（如：DH5α Chemically Competent Cell，Cat#11802）。

2）取10 μL冷却重组产物，加入到100 μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置25 min。

3）42℃热激50 sec，冰浴孵育1-2 min。

4）加入750 μL SOC或LB培养基，37℃孵育2 min充分复苏。37℃，200 rpm，摇菌60 min。

5）5000 rpm离心3 min，弃掉750 μL上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀。待菌液被吸收，将平板倒置，于37℃过夜培养。

常见问答

1、最佳克隆位点选择？

答：在选择克隆位点时，应避免选择克隆位点上下游50 bp内有重复序列的区域。当克隆位点上下游25 bp区域内GC含量均在40%-60%范围内时，重组效率将达到最大。若高于70%或者低于30%，重组效率会受到较大影响。

2、无克隆长出或克隆数较少？

答：出现该情况，建议使用阳性对照，可排除试剂盒本身的影响，并进行进一步判定，主要有以下可能情况：

1）引物设计不合适：推荐【同源序列（15-25 bp）+完整的酶切位点+基因特异性扩增引物】，GC含量40% - 60%。

2）感受态细胞效率低：使用新鲜制备或妥善冻存的感受态细胞，确保其转化效率>107 cfu/μg。每次操作时可设置一组转化质粒的对照实验，以检测感受态细胞的转化效率。连接产物体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率。

3）线性化载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量，或者比例不佳：尽量按照推荐的量和比例配制重组反应体系。

4）线性化载体和插入片段扩增产物不纯，抑制反应：线性化载体和插入片段扩增产物未纯化，直接使用时，使用总体积应不超过反应体系体积的1/5，如20 μL体系不超过4 μL。建议线性化载体、插入片段扩增产物进行凝胶回收纯化，纯化产物溶解在ddH2O中。

3、出现较多假阳性

答：主要有以下可能情况：

1）载体线性化不完全：即使是痕量未完全酶切的载体也会产生很高的转化背景。可通过阴性对照检测载体是否线性化完全，优化酶切体系，提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物等都可以有效减少环状质粒残留。

2）插入片段扩增产物混有非特异扩增产物：建议：①优化PCR体系，提高特异性；②胶回收PCR产物；③鉴定更多克隆。 

3）反应体系中混入了相同抗性的质粒：PCR扩增模板(载体或插入片段)为环状质粒时，若扩增产物直接用于重组反应，残留环状质粒模板会产生较高的转化背景。建议使用预线性化质粒作为扩增模板、扩增产物进行DpnI消化或扩增产物进行胶回收纯化。

4、菌落PCR无条带

答：主要有以下可能情况：

1）引物不正确：推荐使用载体的通用引物或至少使用一条通用引物进行菌落PCR检测。

2）PCR体系或程序不合适：没有目的条带也没有空质粒条带，建议优化PCR体系、程序；或者提取质粒，以质粒做模板PCR验证；或者进行酶切验证。

3）重组失败：没有目的条带，只有空质粒的条带，说明重组不成功，载体线性化不完全，建议优化酶切体系。