以胆酸钠为基础的活性脱除技术（SCARF）用于深层生物样品的快速有效清除和免疫染色

以胆酸钠为基础的活性脱除技术（SCARF）

用于深层生物样品的快速有效透明化和免疫染色

近年来，光学清除技术的发展为理解器官尺度上的结构功能关系提供了解剖学图谱。

洗涤剂介导的脂质去除增强了光学穿透，并允许有效渗透组织内的抗体，十二烷基硫酸钠(SDS)是这一目的最常见的选择。SDS形成大胶束，临界胶束浓度(CMC)较低。从理论上讲，形成更小的胶束和更高的CMC的洗涤剂应该表现得更好，但这些大部分仍未被探索。

在这里，SCARF是一种基于胆酸钠(SC)的活性脱除方法，用于更好地清除和免疫标记厚组织或整个器官。发现SC作为洗涤剂的性能优于SDS，但存在严重的问题：沉淀和褐变。

通过使用离子导电膜来限制SC，同时实现高导电性，可以克服这些问题。与基于SDS的方法相比，SCARF的组织透明度提高了几个数量级，同时很好地保留了内源性荧光，并且能够更有效地穿透一系列抗体，从而在细胞分辨率上揭示各种器官的结构细节，包括坚固的死后人脑组织。因此，SCARF是基于SDS的清除方法的一种强大而优越的替代方法，有望促进各种器官的三维形态制图。

基于水的清除方法使用洗涤剂作为增强光学清除，并允许标记试剂深入组织内部。

十二烷基硫酸钠(SDS)是最常用于此目的的洗涤剂。它有效地去除脂质，但具有高聚集数(80-90)，因此形成大胶束。

SDS的临界胶束浓度(CMC)较低(6-8mm)，不易被冲洗掉，容易卡在组织内。这些影响极大地限制了其渗透组织和随后的抗体染色的速度和能力。清除速度取决于渗透到组织中的速率和洗涤剂胶束对脂质溶剂化的速率。

因此，从理论上讲，形成更小的胶束、低聚集数和高临界胶束浓度的洗涤剂在组织渗透和清除方面表现更好。

事实上，CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲胺]-1-丙磺酸)形成的胶束比SDS小得多，被发现是一种有效的组织穿透试剂，可以在整个人体器官(如大脑、肾脏和眼睛)中显示几厘米深的结构细节。然而，CHAPS是两性离子，所以它只能用于扩散介导的被动清除，因此需要大量的时间使组织透明。

相比之下，通过施加外源力进行主动清除，例如CLARITY的ETC(电泳组织清除)，可以大大加快清除速度。

图1使用胆酸钠和离子导电膜的概念和实现

1）SDS、CHAPS和SC的三维分子和结构特征。与SDS的头尾两亲性相比，CHAPS和SC表现为面亲性(左)。胶束示意图和每种洗涤剂形成的估计聚集数(非实际规模)。由于CHAPS的阴离子性质，它在电上是不可移动的，SDS和SC在组织中的运动可以通过施加电场来促进，与SDS相比，SC可以更有效地通过电力渗透到组织中(右)。

2）实现SCARF的器件设计。澄清室被放置在两个电极之间。在澄清室的每一侧放置并密封两个离子导电膜，并将样品放置在清洗室中。离子导电膜形成物理屏障，防止清除缓冲液直接接触电极，并防止内部清除缓冲液流出样品室。

3）c、d开路系统和分离系统示意图。请注意，在开放系统中，含SC的缓冲液与活性电极直接接触，由于酸性pH导致SC沉淀和褐变，而在分离系统中，这些问题可以避免。

4）e分离样品室的pH值维持在11左右，而开放体系的pH值逐渐呈酸性。

平均值±SD。N = 3。

5）f各系统在80v下清洗180min的1mm小鼠脑样品的明视野图像。样品在开放系统中没有被正确清除并变成棕色，而在分离系统中，样品大部分被清除而没有褐变问题。在不进行RI折射率匹配的情况下拍摄图像，比较SCARF和CLARITY的去除效率。栅格尺寸=1.5×1.5 mm。

因此，满足上述要求的洗涤剂，也可以电移动，将大大促进组织的清理，但这些大部分仍未开发。

本研究开发了一种基于胆酸钠(SC)的脂质去除方法(Sodium Cho-late Assisted Removal lipid for Fluorescent imaging of deep biological tissue, SCARF)，该方法通过胆酸钠(SC)清除脂质和标记厚组织或整个器官。

虽然我们发现使用SC作为组织清除的去除洗涤剂存在严重问题，但我们通过使用离子导电膜克服了SC的局限性。我们发现，与基于SDS的清除方法相比，SCARF具有更好的组织透明度和免疫后染色能力，最重要的是，它的速度要快几个数量级。通过对清除时间、线性膨胀、透明度和荧光保存等参数的比较，我们进一步发现，与其他已发表的方法相比，SCARF是一种优越的清除方法。因此，与基于SDS的清除方法相比，SCARF是一种更好的选择，因此可以显著促进各种透明化生物组织的3D制图。

SC是一种胆盐洗涤剂，其甾体结构具有疏水凸面和亲水凹面，因此具有面亲性。

它具有较高的CMC(14 mm)和较低的聚集数(4-16)，形成的胶束比SDS小得多。由于它不含磺基甜菜碱型极性基团，不像CHAPS，它是一种电可移动的阴离子洗涤剂。

然而，我们发现使用SC作为活性组织清除的洗涤剂存在严重的问题。

首先，与SDS不同，它很容易在酸性到中性ph下沉淀。由于电水解使清除缓冲液酸化，SC产生的沉淀物要么卡在组织内部，要么卡在电极上，从而严重阻碍了清除。其次，当它与载流电极接触时，它会变成褐色，因此在清理过程中会导致组织变褐。

为了克服这些限制，并利用SC作为洗涤剂的优越特性，我们测试了不同的膜，这些膜应该具有高导电性，但密度足以在通过电流时限制SC。由于SC胶束的平均半径被发现为≈10 CMC;，[20]以前用于组织清除方法(如CLARITY)的所有导电多孔膜都无法将小SC胶束限制在隔室中。因此，我们寻找了不同性质的膜，并确定了一种离子导电膜，Nafion。Nafion是一种磺化的四氟乙烯基氟聚合物共聚物，在聚合物电极燃料电池中用作质子交换膜。Nafion膜具有较高的质子导电性(≈100 mS cm−1)，具有优异的热稳定性和机械稳定性。虽然确切的结构仍有争议，但理论上认为Nafion具有相分离的多分支网络，该网络在相互连接的亲水性磺酸内衬水通道和疏水性半结晶聚四氟乙烯主链之间形成共聚物。

我们设计了一个含有SC的样品室，并在室的两侧用离子导电膜将其与周围的电极缓冲液分离。

我们发现这些成功地将SC限制在样品室中，因此我们能够在清除过程中保持室内高浓度的SC，并防止其接触活性电极，从而避免褐变问题。此外，为了避免SC在较低pH下沉淀，我们使用了碱性CAPS缓冲液。虽然周围电极缓冲液的pH值由于电水解而逐渐下降，但分离样品室的pH值保持在pH 11左右，从而阻止了SC的沉淀。离子导电膜的使用提供了另一个好处:由于Nafion几乎没有电阻，我们只需要一个小电流就可以将SC胶束转移到组织中，从而最大限度地减少了热量的产生和组织变形。经过一系列实验，我们设定了以下优化条件:1)10% SC,2) 80V,3)缓冲温度低于40°C，并将该方法命名为SCARF (Sodium Cholate Assisted Removal of lipid for fluorescence imaging of deep biological samples胆酸钠辅助去除深层生物样品的荧光成像脂质)