CD45 微珠，人类

基本信息

[组件]

2 mL CD45 微珠，人：与单克隆抗人 CD45 抗体（同种型：小鼠 IgG2a）偶联的微珠。

[容量]

对于总共 10⁹ 个细胞，最多 100 次分离。

[产品格式]

所有组分均以含有稳定剂和0.05%叠氮化钠的缓冲液提供。

[存储]

避光储存在2 - 8°C。 不要冻结。有效期在小瓶标签上标明。

[分离原理]

首先，用CD45微珠对CD45细胞进行磁性标记。然后，将细胞悬液加载到放置在分离器磁场中的色谱柱上。磁性标记的CD45细胞保留在色谱柱内。未标记的单元格贯穿;因此，该细胞组分的CD45细胞被耗尽。从磁场中取出色谱柱后，磁性保留的CD45细胞可以洗脱为正选择的细胞级分。++++

[背景资料]

CD45微珠用于从外周血、红细胞或血小板制剂、淋巴组织、肿瘤组织或非造血组织中阳性选择或去除白细胞。CD45抗原在所有造血来源的细胞上表达，红细胞，血小板及其前体细胞除外。

[应用]

▲通过消耗CD45白细胞从母体外周血预富集胎儿成红细胞。+

▲ 通过消耗CD45白细胞，从外周血、骨髓或淋巴组织中富集上皮肿瘤细胞。+

▲使用CD235a（糖蛋白A）微珠和CD45微珠通过去除策略富集人骨髓中的多能干细胞。

[试剂和仪器要求]

1.缓冲液：制备含有磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.2，0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2 mM EDTA的溶液。保持缓冲液低温（2− 8°C）。使用前对缓冲液进行脱气，因为气泡可能会堵塞色谱柱。

▲注：EDTA可以用其他补充剂代替，如抗凝剂柠檬酸葡萄糖配方A（ACD-A）或柠檬酸磷酸葡萄糖（CPD）。BSA可以被其他蛋白质替代，如人血清白蛋白、人血清或胎牛血清。含有钙的缓冲液或培养基2+或毫克2+不建议使用。

2. 色谱柱和分离器：CD45细胞可以通过使用MS，LS或XS色谱柱富集，也可以通过使用LD，CS或D柱耗尽。强烈表达CD45抗原的细胞也可以使用MS，LS或XS柱去除。正向选择或耗尽也可以通过使用分离器进行。+

▲ 注意：将某些列插入分隔符需要列适配器。

协议

[样品制备]

当使用抗凝外周血或血沉棕黄层时，应通过密度梯度离心分离外周血单核细胞（PBMC），例如使用Ficoll。

▲注意：为了在密度梯度分离后去除血小板，将细胞沉淀重悬于缓冲液中，并在200°C下以10×g离心15-20分钟。 小心吸出上清液。重复洗涤步骤。

处理组织或裂解的血液时，使用标准方法制备单细胞悬液。有关详细信息，请参阅相应分隔符用户手册的“通用协议”部分。

▲ 死细胞可能与微珠非特异性结合。要去除死细胞，我们建议使用密度梯度离心或死细胞去除试剂盒。

[磁性标签]

▲ 快速起效，保持细胞低温，使用预冷溶液。这将防止抗体在细胞表面封顶和非特异性细胞标记。

▲ 下面给出的磁性标记体积最多为10⁷个总细胞。当处理少于 10⁷ 个细胞时，请使用与指示相同的体积。当使用较高数量的细胞时，相应地扩大所有试剂体积和总体积（例如，对于 2× 10⁷ 个总细胞，使用所有指示试剂体积和总体积的两倍）。

▲ 为了获得最佳性能，在磁分离之前获得单细胞悬液非常重要。将细胞通过30μm尼龙网（预分离过滤器）以去除可能堵塞色谱柱的细胞团块。使用前用缓冲液湿滤。

▲ 在冰上工作可能需要增加孵育时间。更高的温度和/或更长的孵育时间可能导致非特异性细胞标记。

1.确定手机数量。

2.将细胞悬液以300×g离心10分钟。完全吸出上清液。

3.将细胞沉淀重悬于每 80⁷ 个总细胞的 10 μL 缓冲液中。

4.每 20⁷ 个总细胞添加 45 μL CD10 微珠。

5.搅拌均匀，在冰箱（15−2°C）中孵育8分钟。

6.（可选）加入染色抗体，例如10μLCD45-FITC在冰箱（5−2°C）中在黑暗中孵育8分钟。

7.每 1 ⁷ 细胞加入 2− 10 mL 缓冲液，并以 300 × g 离心 10 分钟，洗涤细胞。完全吸出上清液。

8.在 10 μL 缓冲液中重悬多达 500⁸ 个细胞。

▲ 注意：对于更高的细胞数量，请相应地增加缓冲液体积。

▲ 注意：对于用LD柱去除，在1μL缓冲液中重悬至25.10×500⁸细胞。

9.进行磁选。

[磁选]

▲ 根据总细胞数和CD45细胞数选择合适的色谱柱和分隔符。+

使用 MS 或 LS 色谱柱进行磁分离

1.将色谱柱放置在合适的分离器的磁场中。有关详细信息，请参阅相应的色谱柱数据手册。

2.用适量的缓冲液冲洗制备色谱柱：

质谱：500 微升 LS：3 毫升

3.将细胞悬液涂在色谱柱上。

4.收集通过的未标记细胞，并用适量的缓冲液洗涤色谱柱。收集全部污水;这是未标记的细胞部分。通过添加缓冲液三次来执行洗涤步骤。仅当色谱柱储液槽为空时才添加新缓冲液。

质谱：3× 500 μL LS：3× 3 mL

5.从分离器中取出色谱柱，并将其放在合适的收集管上。

6.将适量的缓冲液移液到色谱柱上。通过将柱塞牢固地推入色谱柱中，立即冲洗出磁性标记的细胞。

质谱：1 毫升 LS：5 毫升

7.（可选）为了提高CD45细胞的纯度，洗脱级分可以在第二根MS或LS柱上富集。使用新色谱柱重复步骤1至6中所述的磁性分离过程。+

使用 XS 色谱柱进行磁分离

有关色谱柱组件和分离的说明，请参阅XS色谱柱数据手册。

LD色谱柱的耗尽

1.将LD柱放置在合适的分离器的磁场中。

2.用2 mL缓冲液冲洗制备色谱柱。

3.将细胞悬液涂在色谱柱上。

4.收集通过的未标记细胞并用2×1 mL缓冲液洗涤色谱柱。收集全部污水;这是未标记的细胞部分。通过添加缓冲液两次来执行洗涤步骤。仅当色谱柱储液槽为空时才添加新缓冲液。

CS色谱柱的耗尽

1.组装CS柱并将其放置在合适的分离器的磁场中。

2.通过填充并用60 mL缓冲液冲洗来制备色谱柱。将 22G 流量电阻器连接到组装柱的 3 路旋塞阀上。

3.将细胞悬液涂在色谱柱上。

4.收集通过的未标记细胞，并从顶部用30 mL缓冲液洗涤色谱柱。收集全部污水;这是未标记的细胞部分。

D 柱耗尽

有关色谱柱组装和分离的说明，请参阅D色谱柱数据手册。

使用分离器进行磁选

▲ 用于操作分离器的缓冲器的温度应≥10°C。

▲ 程序选择取决于分离策略、磁性标记强度和磁性标记细胞的频率。有关详细信息，请参阅相应用户手册中描述细胞分离程序的部分。以下计划建议是指分离富含白细胞的血沉棕黄层。

使用分离器进行磁选

1.准备并启动仪器。

2.应用含有样品的试管，并提供用于收集标记和未标记细胞组分的管。将样品管放在摄取端口处，将馏分收集管放在端口 neg1 和端口 pos1 处。

3.对于标准分离，请选择以下程序之一：

正向选择：“波塞尔”

从出口端口 pos1 收集正馏分。

耗尽：“耗尽”

从出口端口 neg1 收集负分数。