CD133 微珠试剂盒 - 人类肿瘤组织

基本信息

[组件]

2 mL CD133 微珠 – 人肿瘤组织：与单克隆抗人 CD133 抗体偶联的微珠（同种型：小鼠 IgG1，克隆 AC133）。

2 mL FcR 封闭试剂，人：人 IgG。

[尺寸]

对于 109总细胞数，最多 100 次分离。

[产品格式]

CD133微珠 – 肿瘤组织以含有稳定剂和0.05%叠氮化钠的悬浮液形式提供。

[存储]

在2-8°C避光储存。 不要冻结。有效期在小瓶标签上标明。

[原理]

首先，CD133细胞用CD133微珠 - 肿瘤组织进行磁性标记。然后，将细胞悬液加载到MACS柱上，该柱放置在MACS分离器的磁场中。磁性标记的CD133细胞保留在色谱柱内。未标记的单元格贯穿;因此，该细胞组分耗尽了CD133细胞。从磁场中取出色谱柱后，磁性保留的CD133细胞可以洗脱为正选择的细胞级分。为了提高纯度，必须在第二根色谱柱上分离含有CD133细胞的阳性选择细胞级分。+++++

[试剂和仪器要求]

● MACS色谱柱和MACS分离器：CD133细胞可以通过使用MS或LS柱富集，也可以通过使用LD柱耗尽。对于CD133表达水平低的细胞，建议使用LS柱，以便在富集过程中获得最佳回收率。强烈表达正选择或去除的细胞也可以通过使用 autoMACS 分离器进行。+

●缓冲液：制备含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）、pH 7.2、0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2mM EDTA的溶液。保持缓冲液低温（2-8°C）。使用前对缓冲液进行脱气，因为气泡可能会堵塞色谱柱。

▲注：EDTA可以用其他补充剂代替，如抗凝剂柠檬酸葡萄糖配方A（ACD-A）或柠檬酸磷酸葡萄糖（CPD）。BSA可以被其他蛋白质替代，如人血清白蛋白、人血清或胎牛血清（FBS）。含有钙的缓冲液或培养基2+或毫克2+不建议使用。

● 管式旋转器。

● 肿瘤解离试剂盒，人类。

● MACS组织储存解决方案。

协议

[样品制备]

处理实体组织时，使用手动方法或解离剂和组织解离试剂盒制备单细胞悬液。

▲ 注意：死细胞可能与微珠非特异性结合。要去除死细胞，我们建议使用密度梯度离心或死细胞去除试剂盒。

由于克隆 293C3 和其他克隆的表位在大多数肿瘤组织中不与克隆 AC133 的表位共表达，因此请勿将其用于评估细胞分离。由于大多数细胞的表达水平低，因此也不可能使用AC133荧光染料偶联物对已经微珠标记的细胞进行荧光染色。为了通过流式细胞术或荧光显微镜评估MACS分离，请使用与PE等偶联的标记检查试剂。

[磁性标签]

▲ 快速工作，保持细胞低温，并使用预冷溶液。这将防止抗体在细胞表面封顶和非特异性细胞标记。

▲ 下面给出的磁性贴标体积最多为107总细胞数。使用少于 10 个时7单元格，使用与指示相同的体积。当使用较高数量的细胞时，相应地扩大所有试剂体积和总体积（例如，2×107总细胞数，使用所有指示试剂体积和总体积的两倍）。

▲ 为了获得最佳性能，在磁分离之前获得单细胞悬液非常重要。将细胞通过30μm尼龙网（预分离过滤器）以去除可能堵塞色谱柱的细胞团块。使用前用缓冲液润湿过滤器。

1. 确定细胞数。

2.将细胞悬液以300×g离心10分钟。完全吸出上清液。

3. 将细胞沉淀重悬于每 60 次 10 μL 缓冲液中7总细胞数。

4. 每 20⁷ 个总细胞加入 10 μL FcR 封闭试剂。

5. 每 20⁷ 个总细胞加入 133 μL CD10 微珠 – 肿瘤组织。

▲ 推荐孵育温度为2-8°C。 更高的温度和/或更长的孵育时间可能导致非特异性细胞标记。在冰上工作可能需要增加孵育时间。

6.充分混合，并使用管旋转器在冰箱（15-2°C）中缓慢连续旋转孵育8分钟。

7. 每 1 次加入 2-10 mL 缓冲液洗涤细胞7细胞并以300×g离心10分钟。完全移取上清液。

8.（可选）加入染色抗体，例如10μL标记检查试剂-PE，充分混合，并在冰箱（5-2°C）中在黑暗中孵育8分钟。

▲ 注意：标记检查试剂可确保对分离的CD133细胞进行最佳的流式细胞术分析。+

9.（可选）每 1⁷ 个细胞加入 2-10 mL 缓冲液，并以 300×g 离心 10 分钟，洗涤细胞。完全吸出上清液。

10. 在 10 μL 缓冲液中重悬多达 500⁷ 个细胞。

▲ 注意：对于更高的细胞数量，请相应地增加缓冲液体积。

11. 进行磁选。

[磁选]

▲ 根据总细胞数和CD133细胞数选择合适的MACS色谱柱和MACS分离器。+

▲ 始终等到色谱柱储液槽为空后再进行下一步。

使用 MS 或 LS 色谱柱进行磁分离

1. 将色谱柱置于合适的 MACS 分离器的磁场中。

2.用适量的缓冲液冲洗制备色谱柱：

质谱：500 微升 LS：3 毫升

3.将细胞悬液涂在色谱柱上。收集含有未标记细胞的流通物。

4.用适量的缓冲液洗涤色谱柱。收集通过并与步骤3中的流出物结合的未标记细胞。

质谱：3× 500 μL LS：3× 3 mL

▲ 注意：仅当色谱柱储液槽为空时，才通过添加缓冲液等分试样来执行洗涤步骤。

5.从分离器中取出色谱柱并将其放在合适的收集管上。

6. 将适量的缓冲液移液到色谱柱上。通过将柱塞牢固地推入色谱柱中，立即用磁性标记的细胞冲洗出馏分。

质谱：1 毫升 LS：5 毫升

7.为了提高CD133细胞的纯度，请在第二根MS或LS色谱柱上富集洗脱级分。使用新色谱柱重复步骤1至6中所述的磁性分离过程。+

LD色谱柱的耗尽

1. 将LD柱放置在合适的MACS分离器的磁场中。

2. 用 2 mL 缓冲液冲洗制备色谱柱。

3.将细胞悬液涂在色谱柱上。

4.收集通过的未标记细胞并用2×1 mL缓冲液洗涤色谱柱。收集总流出量;这是未标记的细胞部分。通过添加缓冲液两次来执行洗涤步骤。仅当色谱柱储液槽为空时才添加新缓冲液。

使用 autoMACS 分离器进行磁分离

1.准备并启动分离器。

2.应用含有样品的试管，并提供用于收集标记和未标记细胞组分的管。将样品管放在摄取端口处，将馏分收集管放在端口neg1和端口pos2处。

3. 对于标准分离，请选择以下程序之一：

正选择：波塞尔德2。

从出口端口 pos2 收集正分数。

耗尽：耗尽。

从出口端口 neg1 收集负分数。