人类CD3微珠

基本信息

[组件]

2 mL CD3 微珠，人：微珠与单克隆抗人 CD3 抗体（同种型：小鼠 IgG2a）偶联。

[尺寸]

对于 109总细胞数，最多 100 次分离。

[产品格式]

CD3微珠以含有稳定剂和0.05%叠氮化钠的悬浮液形式提供。

[存储]

避光储存在2 - 8°C。 不要冻结。有效期在小瓶标签上标明。

[试剂和仪器要求]

●缓冲液：制备含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）、pH 7.2、0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2mM EDTA的溶液。保持缓冲液低温（2-8°C）。

▲注：EDTA可以用抗凝剂柠檬酸葡萄糖等其他补充剂代替式-A（ACD-A）或柠檬酸盐磷酸葡萄糖（CPD）。BSA可以被其他蛋白质替代，如人血清白蛋白，人血清或胎牛血清。含有钙的缓冲液或培养基2+或毫克2+不建议使用。

● MACS 色谱柱和 MACS 分离器：CD3 细胞可以通过使用 MS、LS 或 XS 色谱柱进行富集（正向选择）。CD3微珠可用于去除LD、CS或D柱上的CD3细胞。++

正向选择或耗尽也可以通过使用 autoMACS 分离器来执行。

协议

[样品制备]

当使用抗凝外周血或血沉棕黄层时，应通过密度梯度离心分离外周血单核细胞（PBMC）。

▲注意：密度梯度分离后去除血小板：将细胞沉淀重悬于缓冲液中，在200°C下以10×g离心15−20分钟。 小心地除去上清液。重复洗涤步骤并小心地除去上清液。

处理组织时，通过标准制备方法制备单细胞悬液。

▲ 注意：死细胞可能与微珠非特异性结合。要去除死细胞，我们建议使用密度梯度离心或死细胞去除试剂盒。

[磁性标签]

▲ 快速工作，保持细胞低温，并使用预冷溶液。这将防止抗体在细胞表面封顶和非特异性细胞标记。

▲ 下面给出的磁性贴标体积最多为107总细胞数。使用少于 10 个时7单元格，使用与指示相同的体积。当使用较高数量的细胞时，相应地扩大所有试剂体积和总体积（例如，2×107总细胞数，使用所有指示试剂体积和总体积的两倍）。

▲ 为了获得最佳性能，在磁分离之前获得单细胞悬液非常重要。将细胞通过30μm尼龙网（预分离过滤器）以去除可能堵塞色谱柱的细胞团块。

1. 确定细胞数。

2.将细胞悬液以300×g离心10分钟。完全移取上清液。

3. 每 80 次将细胞沉淀重悬于 10 μL 缓冲液中7总细胞数。

4. 每 20 个添加 3 μL CD10 微珠7总细胞数。

5.充分混合并在15-2°C下孵育8分钟。

▲ 注意：在冰上工作可能需要增加孵育时间。更高的温度和/或更长的孵育时间会导致非特异性细胞标记。

6.（可选）添加染色抗体，例如加入 10 μL CD3-FITC并在 5−2 °C 下孵育 8 分钟。

7. 每 1 次加入 2−10 mL 缓冲液洗涤细胞7细胞并以300×g离心10分钟。完全移取上清液。

8. 最多重悬 10 个8细胞在 500 μL 缓冲液中。

▲ 注意：对于更高的细胞数量，请相应地增加缓冲液体积。

▲ 注：对于LD柱的耗尽，重悬至1.25×108细胞在 500 μL 缓冲液中。

9. 进行磁选。

[磁选]

▲ 根据总细胞数和CD3细胞数选择合适的MACS色谱柱和MACS分隔符 。+

使用 MS 或 LS 色谱柱进行磁分离

1. 将色谱柱置于合适的 MACS 分离器的磁场中。

2.用适量的缓冲液冲洗制备色谱柱：

质谱：500 微升 LS：3 毫升

3.将细胞悬液涂在色谱柱上。

4.收集通过的未标记细胞，并用适量的缓冲液洗涤色谱柱。通过添加缓冲液三次来执行洗涤步骤，每次在色谱柱储液槽为空后。

质谱：3× 500 μL LS：3× 3 mL

收集全部污水。这是未标记的细胞部分。

5.从分离器中取出色谱柱并将其放在合适的收集管上。

6. 将适量的缓冲液移液到色谱柱上。通过牢固地应用色谱柱随附的柱塞，立即用磁性标记的细胞冲洗出馏分。

质谱：1 毫升 LS：5 毫升

▲ 注意：为了增加磁性标记馏分的纯度，可以将其通过新鲜制备的新色谱柱。

使用 XS 色谱柱进行磁分离

有关色谱柱组装和分离的说明，请参阅“XS色谱柱数据手册”。

LD色谱柱的耗尽

1. 将LD柱放置在合适的MACS分离器的磁场中。

2. 用 2 mL 缓冲液冲洗制备色谱柱。

3.将细胞悬液涂在色谱柱上。

4.收集通过的未标记细胞并用2×1 mL缓冲液洗涤色谱柱。收集全部污水。这是未标记的细胞部分。

CS色谱柱的耗尽

1. 组装 CS 色谱柱并将其放置在合适的 MACS 分离器的磁场中。

2. 通过填充并用 60 mL 缓冲液冲洗来制备色谱柱。将 22G 流量电阻器连接到组装柱的 3 路旋塞阀上。

3.将细胞悬液涂在色谱柱上。

4.收集通过的未标记细胞，并从顶部用30 mL缓冲液洗涤色谱柱。

收集全部污水。这是未标记的细胞部分。

使用 autoMACS 分离器进行磁分离

▲ 请参考《自动 MACS 用户手册》，了解如何使用 autoMACS 分隔符。

1. 准备并启动自动 MACS 分隔符。

2. 将装有磁性标记细胞的管子放入 autoMACS 分离器中。对于标准分色，请选择以下分色程序：

正向选择：“波塞尔”

耗尽：“耗尽”

▲ 注：程序选择取决于隔离策略、磁性标记的强度和磁性标记单元的频率。有关详细信息，请参阅 autoMACS 用户手册：“autoMACS 细胞分离程序”。

3.使用“Possel”程序时，收集正分数（出口端口“pos1”）。这是

纯化的CD3细胞部分。+

使用程序“耗尽”时，收集未标记的分数（出口端口“neg1”）。这是CD3细胞部分。