凯氏定氮法测粗蛋白细节要点

凯氏定氮法测粗蛋白细节要点

粗蛋白检测90%以上用凯氏定氮法，这是一个比较繁复的的过程，需要注意以下细节要点。

1. 国标要求样品粉碎过40目，原因有二：1.容易消化；2.样品更均匀，平行结果更好。

2. 一般样品称样量为0.3g-0.5g为佳，称样天平为万分之一天平，保留四位小数。

3. 通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点(290℃→400℃)，加入硫酸铜作为催化剂。硫酸钠比硫酸钾便宜许多，一般用硫酸钠代替硫酸钾。

消化过程：

4. 温度不要直接设定420℃。这样会使温度在急速升高时造成大量氨气产生从而造成氨气逃逸的问题，原因是粗蛋白消化过程涉及到样品浓度逐步下降和温度急速上升造成反应速度急速上升的两种影响因素，但某一时刻温度上升太快，则极容易氨气大量生成而来不及和硫酸结合并逃逸的。建议分阶段升温，即从文火（较低温度）开始慢慢向武火（较高温度）升温消化的过程。

5. 消化温度的设定。一般温度按照阶段升温方式设置，以从200℃开始，最高设置到国标要求的420℃（当然根据样品的不同，消化炉的老化情况，可适当将温度调高10-20℃也没关系）。一般从开始消化到高温保温结束消化3小时就够了。当然根据样品的不同，可以通过测量数据结果再调整消化炉升温程序的最佳模式。

6. 举个例子，如果用的是8孔的消化炉消化样品，但一次只消化4个样，那就建议把4个放置在中间孔位置，毕竟中间的散热肯定没有边上的孔散热快，所以加热保温效果会好一些。

7. 消化炉做蛋白消化，尽量不要敞口消化，厂家都会有配置排气罩，消化时将排气罩盖好。如果没有排气罩，一般将消化管排气孔变小就可以解决,比如用玻璃漏斗放在消化管口上等。敞口消化容易造成消化液体偏少，其主要原因是浓硫酸无法有效回流而挥发掉了。

8. 蛋白消化分自来水水射泵排废气和排废装置。其中自来水排气抽气能力强些，这就根据水压的大小来把水龙头开到适当大，能正常抽出消化时产生的废气即可。但同时消化炉尽量放置在通风橱使用。

所以消化的主要问题--要么消化不彻底，要么氨气逃逸。因此消化验证是非常重要的一块。

蒸馏过程：

9. 蒸馏样品之前需要先预热。预热的目的是使各管道都充满试剂液体，产生的蒸汽得确保充足稳定。预热的步骤，就是拿一根空的消化管，加一些蒸馏水套到仪器上，分别加入所需的试剂，然后打开蒸汽加热即可，5~8分钟一次，预热2~3遍。

10. 加碱液量需要足够。碱液量可以足量多些，但不能少。加碱样品变黑后还要再加5-10毫升碱液，比如有些仪器是计时加碱液量，如果10S能使样品变黑，则把加碱时间设定成12s为宜。否则因为碱性不强，氨气不容易蒸出来。

11. 防止加碱液时消化液反应剧烈。可以先开蒸汽加热使蒸汽出口冒很小的气后，再开始点开加碱开关加碱（同时加热开关也打开），这样就会减少加碱液时产生的剧烈反应，从而降低氨气逃逸，造成结果偏低的风险。

12. 蒸馏量一般至少保证接收瓶达到150ml以上液体，稳妥的做法就是蒸馏到200ml为宜。这样才能确保氨气全部蒸馏出来并被硼酸吸收。可以偶尔用PH试纸测试接收液口处液体判断是否蒸完全。如果为蓝色就为蒸不完全，只有全部为黄色才完全，有少许蓝色则需再蒸半分钟以上再看下。

13. 根据国标要求，在接收液达到150ml时，可以将接收液口脱离液面，并用蒸馏水进行冲洗。以防产生交叉污染和液体倒吸现象。

14. 甲基红--溴甲酚绿指示剂都要用纯乙醇配，并且配完最好放到冰箱里保存，使用时拿出来，用完就马上还回去。这样甲基红--溴甲酚绿指示剂在终点变色非常灵敏。

15. 推荐用盐酸做标准滴定溶液。相比较硝酸和硫酸，盐酸在水中电离效果最好，一般根据样品蛋白含量的高低来选择合适浓度的盐酸溶液，常用的为0.05mol/L和0.1mol/L。

16. 样品定氮后要及时滴定，最好在十分钟内滴定完，最多不得超过半个小时。

17.  滴定终点颜色判断：样品滴定终点颜色要和空白的滴定终点一致，这样才能确保检测的准确性。溶液由兰绿色变为灰紫色为终点。

18.  定氮仪验证气密性回收率。仪器使用久了，可以用硫酸铵来验证气密性，在烘箱用105度烘干2小时即可。全量法直接称取0.1-0.2g直接蒸馏；微量法，则需要用2g定容到1000ml，每次移取10ml蒸馏即可。

总之，蛋白检测是一个复杂的过程，包括试剂的制备、样品的取样、仪器的可靠性、化验人员的细心等等方面，错了任何一步，都会导致实验失败，所以也是经验慢慢积累的过程，确保每一个环节都没有问题，这样结果自然也就准确无误了。