内毒素或脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌外膜 (OM)外叶(OL)的组成部分。它是一种独特的分子,被后生动物免疫系统用作原核生物入侵的标记,并作为多种革兰氏阴性菌OM成分(包括磷脂和表面蛋白)中的单一成分出现。
LPS根据USP参考标准质量要求从其他杂质中纯化出来。 高度纯化的材料被用作标准内毒素 (RSE/CSE),它在历史上一直用于分析定义内毒素。在工业上,有些人希望为各种目的制备一种非纯化的或“天然的标准品”,并将这些制剂称为“天然内毒素”。本文概述了美国药典(USP)1规定的一些标准要求,并详细阐述了内毒素与其他细胞成分不同的定义。
USP 40一般要求<11>的摘录指出:
“美国药典公约(USP标准物质或RS)提供的标准物质是反映特定药物和食品(原料药、生物制剂、赋形剂、膳食补充剂、食品成分、杂质、降解产物、试剂和性能验证标准品)的高度表征本。当批准适合用作USP或国家处方集 (NF) 中文件测试或化验的比较标准(即,作为专著组成部分)时,USP RS也在美国获得官方地位和法律认可。
USP <11> 的“杂质参考标准”部分指出:“杂质参考标准可以作为纯化的单一组分材料或作为多种杂质的混合物出现。” 工业界要维持当前的“内毒素”标准(BET <85>),而不是“革兰氏阴性细胞壁”标准,必须对其进行纯化和高度表征,否则它将成为“混合杂质”标准,并被贴上这样的标签。
图1:分解成相关组成部分的内毒素定义
鉴于本文的简短性质,只能提供LPS定义的初步草图(图1)。主题将仅限于与内毒素标准化相关的项目:
LPS生物合成;
宿主反应的相互特异性;
革兰氏阴性菌外膜的不对称性;
对比成分。
内毒素在自然界中并非随机发生;它是细菌制造过程的产物,该过程涉及九个独立的酶促事件,然后输出到革兰氏阴性细菌细胞表面。LPS中独特的糖包括核心糖、KDO(3脱氧-α-D-甘露醇辛酮酸糖)和O抗原部分中糖的独特排列,用于在表征各种革兰氏阴性细菌食源性疾病暴发(血清分型)时区分细菌菌株。
图2:LPS独特的结构定义3
后生动物系统已经通过其非常具体的反应定义了内毒素。然而,并非所有后生动物的反应都是相同的。几十年来,基于鲎的测试一直是支持药物测试的有效分析替代品。哺乳动物反应的特异性是极端的。通过脂多糖结合蛋白(LBP)从聚集体中选择(纯化)LPS的单个分子,或者可能作为单体,其中已发现血清白蛋白可代替LBP。4分离后,LPS分子被转移到位于TLR4中的MD-2,并引发跨膜信号事件。这大约是分子所能达到的“纯化”程度。TLR4不仅对分子进行测量,而且还根据亚分子部分的潜在差异发出响应信号。
图3:革兰氏阴性菌的LPS激活宿主先天免疫反应。Ryu等人研究了LBP-CD14介导的LPS转移到TLR4-MD-2至单分子分辨率的动态中间体。5
断言LPS本质上是“未纯化的”似乎是语义问题;它在其生物合成中以单一分子开始,在哺乳动物受体中作为单一分子结束。出于哺乳动物检测的目的,它已通过当前的分析方法尽可能地纯化。请参阅图3 中(规范的)哺乳动物检测级联的概述。6
从能量上讲,革兰氏阴性菌的作用是维持与革兰氏阴性菌外膜相关的不对称性。这保持了一个有效的屏障,防止疏水性“斑块”的形成,疏水“斑块”可能允许不需要的物质(即抗生素)不加选择地通过。这是治疗革兰氏阴性菌感染困难的原因之一。如果我们看一下常见的革兰氏阴性菌表面的常见教科书图,就会清楚地看到“不对称”发生的位置(图4)。6
图4:革兰氏阴性和阳性细菌的细胞壁结构6
由于革兰氏阴性菌外膜外叶由LPS组成,而内叶由磷脂 (PL) 组成,因此会发生不对称性。7如果外叶中聚集了足够的磷脂,则细胞有专门的方法来重建不对称性;包括“漂浮”在新的LPS分子中。8内毒素作为单一分子实体的长期定义包括其形成这种不对称屏障的独特能力。因此,磷脂和LPS作为单独的革兰氏阴性菌外膜(图3)的比例是一个重要的属性。
有时,通过描述它不是什么而不是它是什么来定义某物更容易。内毒素不包括其他膜相关分子。它是六种无法通过其他方式检测到的细菌残留物的质量或分析标志物,因此是制药生产中的关键质量属性。一种与LPS共享革兰氏阴性表面的革兰氏阴性菌外膜成分类型是“孔蛋白”。孔蛋白是蛋白质结构,通常以三聚体形式存在,可调节水、溶质和营养物质进出细胞的通道。
图5:反硝化菌胞外表面的高分辨率分析。
A) 膜区域密集排列着孔蛋白三聚体。
B) 在高分辨率下,子结构在单个三聚体上可见。9
革兰氏阴性菌外膜的概念最近发生了变化,因为对活细菌的原子力显微镜(AFM) 研究发现了主导革兰氏阴性菌表面的孔(图5)。9这些编织的蛋白质链形成空心的“管”,从表面向下延伸穿过外膜并进入细胞质(图6D和E)。LPS通过基于鲎的测试提醒制造商注意革兰氏阴性菌的存在;然而,孔蛋白目前还无法被检测到。
图6:革兰氏阴性菌外膜9中孔蛋白的天然超分子组装的原子模型
使用原子力显微镜(AFM),Oestreicher等人。10研究了来自大肠杆菌和类球红细菌的两种典型革兰氏阴性细菌结构,并指出:“我们的研究清楚地表明,这两种类型的细胞都有一个外表面,该外表面覆盖着类似于分枝杆菌的纳米大小的孔网络。” 与LPS一样,孔蛋白是独立的持久结构,具有免疫反应性且难以破坏。“孔蛋白是极其坚固的蛋白质,可以在70°C的5M盐酸胍或2%SDS存在的情况下可以抵抗变性。” 11鉴于孔蛋白本质上具有免疫原性,因此应该引起人们的兴趣。12,13
虽然它不会改变LPS作为强效污染物的作用,但它清楚地表明LPS并不代表整个革兰氏阴性菌表面,其革兰氏阴性菌外膜而是由几种离散物质组成。
三、总结
内毒素的详细定义支持纯化LPS作为标准化杂质(RSE/CSE)的历史和持续使用:
(a)内毒素是一种具有特殊组装的独特结构(九个酶促步骤);
(b)后生动物对LPS的反应(通过TLR4)的特异性与其他反应(例如激活TLR2 的孔蛋白或激活TLR5的鞭毛)是分开的;
(c)它包括内毒素在产生和维持革兰氏阴性菌外膜与磷脂成比例的不对称性方面的作用
(d)它作为与其他外膜结构分开和相邻的单一结构存在,在结构、功能和免疫反应(TLR激活)方面提供了对比。
应努力开发新的测试方法来检测重要的非LPS膜成分。这形成了一个关键的区别。与其设计一种由未纯化的“细胞壁”成分组成且只能检测到内毒素的“天然内毒素”,不如设计一种由未纯化的“细胞壁”成分组成的“天然内毒素”,单个成分(内毒素、磷脂、孔蛋白、鞭毛蛋白等)应该有自己的检测方法和标准,作为扩大微生物污染控制能力。这将提供必要的冗余,而目前检测亚细胞革兰氏阴性细菌假象的全部权重都落在了内毒素上。
杂质测试的适当标准是分析测试的重要组成部分。根据USP <11>,标记为“天然内毒素”的杂质混合物不是内毒素,而是可能含有内毒素、蛋白质、磷脂、核酸和孔蛋白的混合物。今天基于鲎的测试是针对内毒素的,而不是针对非内毒素的细胞壁或细胞质成分;这种特异性在鲎C因子和哺乳动物TLR4检测架构中都是固有的。内毒素的定义是一个跨学科的定义,不能随便重新定义。
参考文献
1. USP40-NF35 (Official as of 1-May-2018)
2. Wang X, Quinn, PJ. Lipopolysaccharide: Biosynthetic pathway and structure modification. Progress in Lipid Research 2010; 49: 97–107.
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4. Esparza et al. Endotoxin-albumin complexes transfer endotoxin monomers to MD-2 resulting in activation of TLR4, Innate Immunity, Innate Immun. 2012. 18(3): 478–491.
5. Ryu et al. Reconstruction of LPS transfer cascade reveals structural determinants within LBP, CD14, and TLR4-MD2 for efficient LPS recognition and transfer. Immunity 2017. 46, 38–50.
6. Berezin et al. Replacing a Century Old Technique – Modern Spectroscopy Can Supplant Gram Staining. Scientific Reports 2017. 7: 3810.
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13. Pérez-Toledo M. Salmonella Typhi Porins OmpC and OmpF Are Potent Adjuvants for T-Dependent and T-Independent Antigens. Front Immunol. 2017. 8: 230.
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