与其他无脊椎动物类似，鲎缺乏获得性免疫系统，但它有多种先天免疫防御系统。这种防御系统一般分为细胞免疫和体液免疫，主要包括血淋巴凝血、酚氧化酶激活、细胞凝集、抗菌物质释放引起的抗菌反应、活性氧的形成和吞噬作用，共同构成鲎的先天免疫系统。该系统可以对潜在病原体表面的抗原产生免疫反应。因此，需要对各种病原体上具有略微不同结构的各种类型的表位具有足够特异性识别能力的生物传感器。同时，生物传感器必须能够区分“自身”和“外来”表位。  在漫长的生物进化过程中，鲎变形细胞溶解物的血细胞形成了以丝氨酸蛋白酶C因子和G因子为生物传感器的凝血系统。它们分别被革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分LPS或真菌细胞壁的主要成分(1→3)-D-葡聚糖自动催化激活。即当细菌或真菌侵入血淋巴时，血细胞在其表面检测到LPS或(1→3)-D-葡聚糖，血细胞迅速进行胞吐，释放出大小颗粒。C因子或G因子这两个生物传感器被相应的激活剂激活，启动凝血级联反应，最终使凝血原形成凝血蛋白凝胶。

脂多糖中性溶液在室温可放置数月，其生物学活性不发生明显的改变，如置入4℃或低温冰箱，则其生物学活性可保持数年至数十年不变。干燥的脂多糖中性粉剂，在室温或冰箱条件下可放置几十年或更长时间而不失去其生物学活性。  脂多糖在酸性溶液中置室温，其分子发生部分降解，这一变化主要涉及到多糖与类脂A间糖苷键的裂解，及类脂A1-糖苷键的裂解，加热可促进这一反应。强酸溶液在加热条件下可使脂多糖彻底破坏。碱性因素对脂多糖分子的影响较大，主要表现在类脂A分子上。此时类脂A骨架上联结的4-磷酸酯键及3与3位上脂肪酸酯键易遭到破坏，可使分子发生裂解。此时降解后的分子便失去了典型的内毒素活性。强碱条件下可使脂多糖彻底破坏。

脂多糖的物理性状主要表现为集聚程度，集聚度的大小对于生物学活性有着非常显著的影响。对于某种特定的脂多糖其各种盐类的生物学活性强弱可不一。实验表明随着脂多糖盐类集聚度的增加(表现为沉淀系数的增加)，则脂多糖的抗补体作用亦相应地增加。高度集聚的脂多糖钠盐表达出极强的抗补体活性。其他低集聚度的脂多糖盐，则表现为弱抗补体活性。脂多糖的三乙胺盐(S =9.0)则完全缺失抗体活性。  除了抗补体活性外，其他生物学活性亦受到脂多糖物理性状的影响。实验结果表明:低集聚度的脂多糖分子能导致极强的家兔发热反应及小鼠致死毒性，而另--方面，高集聚状态的脂多糖分子易与细胞膜发生作用，可从血清中得到清除，并导致较强的大鼠致死毒性。而脂多糖的其他生物学活性，如致有丝分裂反应及鲨试剂凝集反应等活性，却不易受到分子集聚程度的影响。

根据О-特异性侧链的存在与否可将脂多糖分为光滑型(smooth-form S-脂多糖)和粗糙型(rough-form R-脂多糖)两大类，前者的组成成分只有类脂A、核心寡糖及O一特异性侧链，而居者仅含有类脂A及完整或部分核心成分。虽然两类脂多糖在某些物理特征上表现出显著的差异性（主要为表现分子量及水溶性方面)，但在如下方面具有相同特征: 1.内毒素经口服毒性较小，人血则毒性很大。例如人口服150mg 内毒素无不良反应，而静注0.1 ~0. 5ng/kg 即可引起发热、头痛、恶心呕吐等临床症状。两者剂量相差百万倍以上。 2.内毒素作用无特异性，反复作用机体可产生耐受。 3.内毒素耐高热，一般消毒方法不能灭活，受污染后清除较困难。 

1．磷脂细菌外膜所含的磷脂成分与真核细胞膜的成分极为相似，有一点有意义的区别在于细菌(如大肠杆菌等)外膜含有多量的磷脂酰乙醇胺。其他的成分有磷脂酰甘油及心磷脂等。磷脂是组成外膜内叶的主要分子，而外膜的外叶则是由内毒素及磷脂分子共同组成的，亦即由磷脂一磷脂所形成的双层膜结构仅局限于外膜的局部区域。由于细菌内毒素与磷脂分子在结构上具有高度的相似性，故而这种由磷脂—磷脂，磷脂—内毒素所组成的外膜结构并不影响外膜的稳定性。  2.内毒素内毒素系革兰氏阴性菌及某些阴性菌样微生物外膜中的一种结构成分，在文献中更常用的术语为脂多糖(LPS)，对于细菌外膜的结构与功能起着十分重要的作用。内毒素由寡糖支链和类脂A组成，前者为核心多糖，后者为内毒素分子的主要毒性成分及生物学活性中心。类脂A可与机细胞生物膜上的磷脂相互作用，产生多种生物活性。内毒素具有多种生物学效应，能使宿主机体发热、白细胞增多、直至休克死亡。 3.多糖成分肠杅菌科在外膜中含有一种特征性的多糖成分称为肠道共同抗原(enterobacterial common antigen，ECA)。这是一种酸性多糖。含有N-乙酰-D-氨基葡萄糖，N-乙酰-D-甘露糖酸及4-乙酰氨基-4，6-脱氧-D-半乳糖。--般的ECA结合于外膜的磷脂分子上，而在所谓的ECA-免疫原性菌株ECA 则结合于内毒素的核心部位。  4．蛋白质细菌外膜分子组成中的一半为蛋白质，外膜中所含的蛋白质种类较多，但仅存在几种称为主要蛋白(major proteins)的分子成为外膜蛋白的主要成分，这类蛋白质包括透道蛋白( porins)和外膜A蛋白(outer membrane protein A，Omp A)，这两类蛋白质的分子量均为35000d左右。此外，外膜中还含有胞壁脂蛋白，但其分子量要小得多(7200d)。如果细菌培养环境改变，则主要蛋自的组成可发生变化。

想必大家都已越来越清楚外膜结构对于革兰氏阴性菌起着十分重要的生理作用。由于外膜的存在，使得细菌对机体的防御性体液因子，如溶菌酶、β-溶解素及许多白细胞毒性蛋白具有抵抗作用，而这类物质一般讲对于革兰氏阳性菌具有高度的毒性。存在于人或动物肠道中的革兰氏阴性肠杆菌其外膜得到了高度的发达，并成为一种有效的屏障结构，这样，这类细菌不易收到胆盐的去垢作用及消化酶的降解作用。 另外，肠道及其他的一些革兰氏阴性菌的外膜，对于许多抗菌素如大内环类抗生素﹑新菌素，利福平，林可霉素、柯林达霉素及梭链孢酸等具有屏障作用。即使有微量的抗生素进入细胞，细菌体内的酶系统亦较易将抗生素灭活，因而革兰氏阴性菌经常易建立对抗生素的高度抵抗性。细菌外膜这些功能与现代医院中革兰氏阴性菌的感染流行是密切相关的。  细菌外膜的另一个重要功能就是提供细菌表面高度的亲水性，这一点在防御机体吞噬作用、补体的攻击作用，以及通过膜表面抗原的改变而抵抗特异性免疫攻击等作用中有着十分重要的意义。当然，细菌外膜的这些功能与其中存在的内毒素亦有密切的关系，这也就是内毒素在外膜中所发挥的主要作用。

所有细菌的表面均具有一层称为细胞壁(cell wall)的结构，位于细菌细胞最外层，包在细胞膜周围，是一种膜状结构，组成成分较复杂，并随不同细菌而异。但其主要组分是肽聚糖( peptidoglycan)(又称粘肽、糖肽﹑胞壁质)，肽聚糖的存在提供了细菌细胞壁的强度，具有机械性保护意义。革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌尚各有特殊成分。革兰氏阳性菌的肽聚糖由聚糖骨架、四肽侧链和五肽交联桥三部分组成(图1)；  革兰氏阴性菌者仅由肽聚糖和四肽侧链两部分组成(图2)。  革兰氏阳性菌细胞壁的结构与组成革兰氏阳性菌细胞壁较厚(20 ~80nm)，除含有15~50层肽聚糖结构外，尚有许多特殊组分磷璧酸( teichoic acid)(图3)。 某些革兰氏阳性菌细胞壁表面尚有一些特殊的表面蛋白质组分，如A群链球菌的M蛋白,金黄色葡萄球菌的A蛋白等。 革兰氏阳性菌细胞壁的结构与组成 革兰氏阴性菌的细胞壁较薄(10 ~ 15nm)，但结构十分复杂，革兰氏阴性菌除含有1~2层的肽聚糖的外侧还含有一层称为外膜(outer membrane)的“单位膜”结构(图4)。外膜由脂质双层(磷脂)脂蛋白和脂多糖三部分组成，脂蛋白使脂质双层联结在肽聚糖层上。由脂质双层向细胞外表伸出的部分即为脂多糖(LPS)。 脂多糖包括类脂A或称脂质A、核心多糖和特异多糖三个组成部分，习惯上将革兰氏阴性菌细胞壁中的脂多糖分子作为一个整体称为细菌内毒素。应用现代分子生物学方法，可以将细菌外膜完整地从细胞璧中抽取出来，而不受细菌其他结构及成分的影响。与细胞膜比较，外膜中所含的蛋白质种类甚少，但存在的总量却很高。外膜所含有磷脂种类亦很少，其中以磷脂酰乙醇胺为主。某些野型细菌（如鼠伤寒沙门氏菌）外膜中所含有磷脂量极少，甚至不足以组成外膜的一个单层。另一方面，外膜中含有一种特征性的成分即内毒素，每个菌细胞所含的内毒素分子数可达2.5×106，这些分子全部分布于外膜的外叶中，约占外膜总表面积的45%(图5)。应当指出的是，不同种属的细菌，它们外膜的化学组成可有不同.某些粗糙型突变株细菌外膜中的磷脂含量极高，而蛋白质成分极低，但内毒素分子数目却基本保持恒定。

内毒素诱导的内源性细胞因子有哪些？机体受内毒素（LPS)刺激后，可直接或间接地刺激免疫活性细胞产生多种内源性调节因子，故在体内形成一个细胞因子网络。这些细胞因子在LPS生物学活性表达过程中起着十分重要的作用。目前比较清楚的由LPS刺激产生的细胞因子主要有:肿瘤坏死因子类( tumor necrosis factors ， TNF)、干扰素类(interferons，IFNs)、白细胞介素类(interleukins， IL—s)集落刺激因子类(colony-stimulating factors ，CSFs)等。这类内源性因子可发挥免疫调节作用，从而起到增强机体抵抗力的作用。  内毒素与机体免疫系统的相互关系是怎么样的？我们生活在充满内毒素的环境中，自我们出生的那天起，我们就受到细菌内毒素(特别是正常肠道菌)的感染，并与内毒素的“共生"状态将持续整个人生。即使是消毒的食物亦含有内毒素，因为内毒素相当耐热，200℃干烤亦需2~4小时才能使内毒素彻底破坏，因而我们不可能创造一个严格的“无内毒素”生命。动物实验已证明，所谓的“无菌动物"对内毒素及细菌感染高度敏感，因而这种动物患细菌感染时的死亡率极高，而一般的动物则对细菌感染及应用内毒素有相当的基础免疫力。这一事实说明内毒素对于机体免疫系统的发育成熟起着重要的作用。我们的祖先在几千万年的进化过程中与自然界作斗争的结果形成了我们现在的“内毒素适应状态”。故而内毒素在人类进化史上具有重要的意义。可以设想，日常生活中体内极微量的内毒素的不断进入，将伴随人类整个生命过程，并成为一种具有高度活性的“外激素" (exo-hormone)。  内毒素检测自1980年美国药典第二版收载细菌内毒素检查法(鲎试验法)以来，该项试验在药品质量控制方面取得了很大进展。中国药典1995年正式收载鲎试验法(Limulus test)用于0.9%氯化钠注射液等药物的细菌内毒素限量检查，最近又拟定将细菌内毒素的定量检测纳入2000版中国药典。近年来国外在临床方面应用鲎试验法测定体液中的内毒素含量特别盛行，尤其是在日本，以合成基质法为中心的血浆中内毒素的含量测定研究进行得比较深人，我国也正在开展此方面的研究。但必须记住的一点是，对于临床病人内毒素检测的敏感性必须提高到1pg(10-12g/ ml)的水平，并必须更深入地了解内毒素检测的意义。

临床上，不同浓度的葡萄糖注射液、生理盐水注射液、氯化钠注射等常被用于静脉注射使用。这些注射液在被临床应用前，都需要经过内毒素检测，唯有内毒素检测合格的注射液，才能真正用于临床使用。以前较为经常使用检测细菌内毒素的方法多为家兔热原法，直到近年来，国内外许多研究这方面的专家应用了鲎试验法和家兔热原法进行了大量的研究，他们发现，在用鲎试验法和家兔热原法进行内毒素检测时，两种方法的试验结果基本一致，但是较为明显一点的是：鲎试验法比家兔热原法的灵敏度高达10~100倍。  在1977年的时候，Travenol实验室就对他们国内各个厂家生产的静脉输液还有其他医疗器械进行内毒素检测。为了更好地对比检测结果，Travenol实验室分别应用鲎试验法还有家兔热原法进行检测，结果显示，使用家兔热原法进行了28410次内毒素检测时，不合格的批次为4次，而应用鲎试验法进行143196次内毒素检测，发现呈阳性的产品为37次。这次的检测结果表明，鲎试验法具有操作简单、检测结果准确、灵敏度高的优点，所以应用鲎试验法对静脉注射液以及医疗器械进行内毒素检测时可行的。在静脉注射液以及医疗器械的制作流程中使用鲎试验法，对它们的生产原料、生产半成品以及终产品进行细菌内毒素检测，能有效杜绝污染，保证静脉注射液以及医疗器械的临床使用安全性。需要注意的是，关于Ca++这类浓度值较高的注射液容易出现假阴性的结果，所以每一次的鲎试验中，特别是第一次测试不知名药品时一定要对它们做一直对照试验，保证试验结果的准确性。

内毒素在1892~1895年期间，就已经被发现了。现在，我们已经非常清楚地知道：内毒素（endotoxins）系存在于革兰氏阴性菌细胞壁外膜中的脂多糖（lipopolysaccharides，LPS），即含有亲水性的多糖部分和一个疏水的类脂A。多糖部分由О抗原侧链和核心多糖组成，类脂A的基本结构为脂酰化的二磷酸β1，b-D-氨基葡萄糖双糖，是脂多糖发挥生物活性不可缺少的部分，脂多糖在结构及功能上具有三个“两性”特征，即属于两性（亲水性、疏水性）分子，携带两极（正、负）电荷，及发挥两相（有益、毒害）作用。  内毒素是一类具有高度活性的分子，对机体具有广泛的生物学作用，故而在革兰氏阴性菌感染的发病机理中起着十分重要的作用。革兰氏阴性菌感染时释放的内毒素或静脉注射提取的内毒素，可发生严重的致死性内毒素休克（endotoxin shock），其特征是从休克可逆期到不可逆期的转变期相差极短，往往只有数分钟至2小时。故而临床医生常常来不及采取有效的治疗措施。除此之外，如果在体内应用少量的内毒素，可观察到有显著抗肿瘤﹑增强机体非特异性抵抗力，抗放射及移植物对宿主的排斥反应等有益作用。

内毒素到底是怎么被发现的呢？在1892~1895年期间，Richard Pfeiffer首次报道：革兰氏阴性菌的细胞壁中含有有毒物质。他在研究霍乱弧菌感染的发病机理时，发现该菌可产生两种具有不同性质的毒性物质，一种为由活菌合成并释放出来，对热敏感的蛋白质成分即外毒素（exotoxin）；另一种为对热抵抗，并且只有当细菌崩解后才能释放出来的非蛋白质成分，他将后一种毒性物质称为内毒素（endotoxin）。  紧接着，意大利的 Centanni通过自溶的方法从各种革兰氏阴性杆菌中提取到了类似的毒性物质，他称其为致热毒素（pyrotoxina），因为这类物质在表达毒性的同时始终亦表达出显著的发热反应活性。同时期，德国的Hans Buchner证实从多种细菌提取得到的内毒素物质除引起发热外，还可引起白细胞数目的改变，并可显著增强机体对细菌感染的抵抗力，从而 Buchner开创了“非特异性疗法"或称“发热疗法”。纽约的外科医师 William B.Cole将加热杀死的灵杆菌和化脓性链球菌上清滤液应用于各种恶性肿瘤（特别是肉瘤）的治疗，并取得了较为满意的疗效。他将其应用的细菌上清液称为Coley 氏毒素。此后，Murray J. Shear证实Coley氏毒素中发挥抗肿瘤作用的物质为内毒素。  1933年Boivin等人在研究鼠伤寒杆菌的致病机理时，用三氯醋酸提纯工艺首次从鼠伤寒杆菌中提取出内毒素。1952年Outo Westphal 发现衣原体、立克次氏体、螺旋体等细胞壁中也含有内毒素。但是，直到50年代内毒素的化学本质才被阐明。德国的Oto Westphal和Otto Luderitz首先介绍了提取高纯度内毒素的方法——酚水法，使得内毒素分子的化学组成和结构分析成为可能。从而开创了内毒素化学和内毒素生物学研究的新时代。

鲎试验法中，有不少方法可以检测细菌内毒素含量，其中一种就是荧光测定法。那荧光测定法在试验中是怎么进行操作的呢？首先需要将荧光母素和鲎试剂充分混匀，这样蛋白分子在进行凝胶反应的同时，荧光素就可以将其标记上。  在凝胶逐渐形成的过程中，蛋白分子的聚合结构也会慢慢发生变化，与此同时，与荧光素结合的蛋白因子也会跟随水分子的运动从而进行同步旋转，使得荧光的偏光度会发生变化。这时，我们将荧光的偏光度设为P，垂直的荧光强度设为I1，水平的荧光强度设为I2,,然后可以看得出，P值会因为凝胶的凝固程度而发生变化，这个时候想要求出其中的值，可以根据下图公式计算得出：  根据此公式可以得出，P值和供试品中的细菌内毒素含量为线性关系。在进行鲎试验时，荧光母素的常用浓度一般为0.02%，若荧光母素的浓度超过0.05%以上，蛋白分子的聚合结构就会受到抑制，发生明显的变化，而荧光母素的浓度在0.025%时，蛋白分子的聚合结构会受到轻微抑制。所以，我们一般选定荧光母素的常用浓度为0.02%。鲎试剂在凝固的过程中会随时影响P值得变化。当凝胶逐渐凝固时，P值就会越来越大，而内毒素的浓度又决定了鲎试剂凝固的反应期的时间长短和P值的增大变化。当内毒素值为10-2μg/ml的时候，P值就会在五分钟内开始产生增大的变化；若内毒素值在10-3μg /ml的时候，P值在30分钟时都不会又明显增大的变化；又若是内毒素值在-3μg /ml的时候，因内毒素的浓度值过小，鲎试剂凝固的反应潜伏期就会越长。这个时候就能根据P值的上升程度绘制出图像，从而得出回归直线方程值。这时，我们设倾斜度为b，潜伏期为t ，计算出b/t值。根据荧光母素浓度的不同计算出标准内毒素的值然后绘制成曲线图像，可以得出内毒素含量在10-8～10-3μg /ml范围时，整体是呈上升直线状的，可以得出相关系数：0.9804由此列出方程式： Y = 0.0207 + 0.0797x，其中 (R = 0.9804)由此标准曲线可以得出供试品中的细菌内毒素含量需要注意的是，荧光测定法的试验操作均在0℃的环境中进行操作，在进行60分钟静置时，还需时刻观察试验的反应过程，然后每5分钟就需要进行一次测定。总而言之，荧光测定法需谨慎、耐心，方可得到准确的结果。

内毒素（Endotoxin）的存在可能会引起广泛的病理变化，如发热、Shwartzman反应、弥漫性血管内凝血（DIC）、炎症细胞因子的释放等，严重者可导致内毒素血症及致死性的内毒素休克，后者的死亡率可高达40% ~60% ，且其发生率有逐年上升的趋势。 针对内毒素及其毒性效应而设计的抗内毒素治疗已成为国际上学术界研究的热点之一。这些治疗措施主要包括:内毒素及类脂A抗体（中和作用），无毒/低毒类脂A类似物（拮抗作用），化学药品（如多糖菌素B及其衍生物，化学吸附作用），抗细胞因子抗体（中和内毒素诱生的炎症细胞因子），抗内毒素“受体”抗体（如封闭内毒素的膜结合及可溶性“受体”）等，这些治疗措施的动物实验显示出良好的抗内毒素效果，但Ⅱ～Ⅲ期临床试验的结果不甚理想，所以设计与研究有效的抗内毒素治疗方案并有效地应用于临床实践是内毒素研究领域的最大难题。  目前，国家已研究出以高热内毒素血症为主要适应症的新药，该药遵循了中医药理论，是从大量的中医经验方和单味中药的广泛临床和实验研究中筛选出来的。在大量的动物实验以及广泛的临床实验中证实到，这些新药能有效抑制内毒素中的鲎试剂凝集反应，对内毒素所致小鼠致死性毒性具有良好的拮抗作用，对内毒素引起的家兔发热亦有良好的拮抗作用。 相信在不久的将来，内毒素的诊断、检测、治疗会越来越来理想。

近百年来，人类对内毒素本质、化学结构、医学生物学性质的研究，均有赖于从细菌中分离或人工合成纯品。特别是1968年美国学者Jack Liven创建鲎试验（Liniulus test），使内毒素的定性、定量测定成为一种十分简便的方法后，在医药卫生领域，吸引了更多学者对内毒素研究的兴趣。 鉴于内毒素的首要生物学活性是引起哺乳动物发热，各国药典纷纷收载《细菌内毒素试验》，作为《热原试验》的补充，为了统一国际间内毒素量值，使试验结果具有可比性，世界卫生组织（WHO）于1986、1994年两次组织国际协作标定，建立了“内毒素国际标准品”。有关在药品注射液中内毒素的检测方面，国内做了大量工作，取得很大成绩。但是，应当指出，内毒素不等同于热原，寻求建立新的热原试验方法，仍然是摆在药品检验人员面前的艰巨任务。  内毒素检测的另一个重要应用领域，则是在基础与临床医学方面。众所周知，当肝脏解毒功能受损，出现内毒素血症是不可避免的，导致诱发内毒素相关性疾病，因此，早期诊断、治疗内毒素血症是十分重要的。所以希望更多学者能关心、投入这一研究领域，为共同攻克内毒素相关性疾病作出贡献。

1980年，瑞典学者Gardi最先发明了毛细吸管法。 那凝胶法中毛细吸管法到底是怎么应用的？ 首先，需要分别使用10μl的供试品和10μl的鲎试剂将它们滴在载玻片上，这个载玻片必须是无菌无热原的。接着需要将它们充分混匀，然后使用毛细吸管吸进去，吸进去的高度为毛细吸管的三分之二即可，再将它们在37℃的环境中静置45至60分钟。最后，将毛细吸管取出来，把它浸入溴酚染料中，只需浸入2至3秒即可，再次取出就能判断出试验结果了。  观察时，若发现染料进入了毛细吸管里面，就可以知道供试品中是没有内毒素的，或者可以说是该样本所含有的内毒素含量比鲎试剂检测的灵敏度要低，这时只需记为（-）即可；但是如果试管内部形成了坚硬的凝胶，染料没能进入试管内部，就可以知道该样本含有细菌内毒素，此时记为（+）即可。 毛细吸管法优点很多，其中包括检测灵敏度高、操作检测便捷，静置所需要的时间较短，更重要的是试剂消耗量小，可大大节约检测试剂，试验结果的判断也比较准确客观，是凝胶法中检测细菌内毒素的好方法。 在临床上，应用此法对多种样本进行细菌内毒素检测，都能得到满意的结果。

在凝胶法中，由于试管法的使用会消耗大量的鲎试剂，以及在试验时使用的时间较长、对试验结果判定难以标准化的问题。在1974年的时候，有个叫Frauch的科学家首先创立了玻片法。 那玻片法的使用方法到底是怎么样的呢？ 在Frauch的介绍中说到，首先需要取出10μl的鲎试剂和在试验前就已经处理过的供试品10μl，均滴在无菌无热原的玻片上，接着将这两者充分混匀，再在37℃的环境中静置30分钟，最后取出观察试验结果。若发现被检样品中含有内毒素，混合物就会形成凝胶，且把载玻片倒置时混合物不会流动并且摸起来很牢固。相反，若被检样品不含内毒素或者内毒素含量较低，混合物就不会形成凝胶，且混合物还会呈流动状，  到了1977年的时候，Goto等科学家又对玻片法进行了两点改进。 第一点，对鲎试剂以及供试品的使用量均增加到20μl。之所以要增加量，是因为Goto等人发现Frauch的玻片法在对鲎试剂以及供试品的使用量中仅仅使用10μl，由于量太少的原因，在试验中就会发现，若是被检样品能形成凝胶，但是被检样品的体积就会变得更小了，更加难以对试验结果进行判断结果。所以将鲎试剂以及被检样品的使用含量增至一倍，这样的话，试验结果的判定就会更加容易，准确度也会更高。 第二点，就是不再使用含有硅含量的玻片进行试验。因为使用含有硅含量的玻璃制成的玻片，在试验中将鲎试剂及供试品滴在上面，会使这两者的液体向四周扩散，显得非常不规律，在观察试验结果时，就会难以判断试验结果。但是若是使用含有硅含量的玻璃制成的玻片进行试验，滴在上面的鲎试剂以及供试品就会显得非常稳定，不会向四周扩散，这样的话，对试验结果的判断也会更容易些。 总而言之，凝胶法中的玻片法，也是一个检测细菌内毒素的好方法。

在凝胶法中，经常使用的方法就包括试管法。 那在凝胶法中，试管法的使用方法是怎么样的呢？ 首先需要把供试品和鲎试剂等量加入试管中，轻摇晃使其充分混匀，再将该试管置于水浴中静置，取出后再观察该试管的凝胶是否形成。试验时，需要作试验管、阳性对照管、阴性对照管及阴性抑制对照管共4种，来作对照试验。 1.试验管 需要取出0.1ml的样本和0.1ml的鲎试剂。水、注射液等一般样本在试验前是不需要进行处理的，但是如果血液、腹腔渗出液等其他液体就必须在试验前就进行处理，因为这些样本可能存在鲎试验法反应的抑制物。所用的鲎试剂需要在试验前就对其以标准内毒素进行校准，且是可以进行试验的。 2.阳性对照管 分别取出0.1ml的标准内毒素和0.1ml的鲎试剂，在使用标准内毒素时应以WHO标准品进行校准标定。在实验中应用的内毒素浓度需要根据鲎试剂的灵敏度来确定，一般来说，范围在1～5 ng/ ml即可。 3.阴性对照管 只需取0.1ml的无热原水和0.1ml的鲎试剂即可。 4.抑制对照管 需要取0.1ml的供试品和0.1ml的标准内毒素和0.2ml的鲎试剂。 上述四管均放入37℃孵育1～2小时观察结果。如形成凝胶坚固，试管倒转180度不变形，则记为（++）；如混浊度和粘滞性明显增加，呈胶体状，但倾斜试管时变形，则记为（+）；如液体流动自如，透明无变化或稍混浊，有少量颗粒细絮片状物，则记为（-）。  以上对照的4支试管需要在37℃的环境中静置1~2个小时，再对试管进行观察，以此来得出结果。如果试管中形成的凝胶是凝固的，且将试管翻转180度都不会变形时，则该试管被记为（++）；但是如果试管出现了混浊的情况而且试管内还有粘滞性的情况，整体是呈胶体状的，将试管倾斜时液体也会呈倾斜，则记为（+），如果整个试管的液体是非常流动的，且试管内部呈透明色或者只有轻微混浊，且出现了些许颗粒细絮物，则记为（-）。 如果供试品中出现了抑制物，可以把供试品进行处理，比如将其进行稀释，或者用其他方法将抑制物清除，再重新进行检测。如果这些方法都没有效果的话，还可以采取其他细菌内毒素检测方法，比如家兔法（Rabbit pyrogen test）。

鲎试验法（鲎变形细胞溶解物试验）是第一个被美国作为检测细菌内毒素的法定方法的，美国还将此法纳入了美国药典第20版（1980）中，并对该法进行了非常详尽的介绍。慢慢地，也有许多国家也将鲎试验法作为检测细菌内毒素的法定方法。现在就以美国为例子，来详细阐明鲎试验法。 美国食品药品管理局（FDA）有这样一条准则，即只要是给人类使用的药品、生物制剂、医疗器械等产品最后一定要使用鲎试验法进行细菌内毒素检测，只有检测过关的产品才能得到美国食品药品管理局的承认。 那鲎试验法作为检测细菌内毒素的法定方法，在进行试验检测前应该做些什么呢？ 首先，需要对鲎试剂的灵敏度进行检测。 不同的实验室对鲎试剂的操作肯定会出现不同的差异，所以检测人员在进行检测前必须要对同一批次的鲎试剂以及同一批次的内毒素作稀释度试验。一般来说只需要4~8个批次试验即可，然后再以2倍的倍比稀释来选取终点范围值作鲎试验法。 终点的细菌内毒素含量用ng/ml进行表示，接着将其换算成log值，最后再来计算标准差，即SD值。如果出现了4个批次的稀释度的标准差值都小于或者等于标准差值99%的限度值，那么该方法是可以进行使用的。但是，如果标准差值有8个稀释度的标准差超过99%的上限值，那么该方法就会因为变异较大而不能使用，必须要在重新试验前找出不可用的原因再进行纠正。  假如实验室最终通过了上面出现异常的变异试验，接下来就应该按照一系列浓度的参考标准内毒素（RSE）或对照标准内毒素（CSE）来检测鲎试剂的灵敏度，若最终鲎试剂的灵敏度差异没有超过指定标定值的2倍稀释，那最终鲎试剂的灵敏度是可行的。 其次，要对鲎试剂进行抑制与增强试验。 将一种药物与水中的一系列同种内毒素浓度进行比较，其中该药物含有不同的标准内毒素（灵敏度以鲎试剂标定），待检测结果出来后，再比较标准系列的内毒素检测结果和药物中的内毒素检测量，如果两者的差异结果没有超过2倍的稀释浓度，则认为该药物有抑制或增强现象。 要注意的是，如果该药物成分较为恒定，则在检测时只需检测该药物的最高和最低浓度就可以了，但是如果药物的浓度都有抑制或者增强的作用，就必须每一种浓度都要进行抑制或增强试验。所有法定的药物检测都必须在没有稀释或在适当稀释后再进行检测，且稀释倍数不能超过最大有效稀释倍数，否则其中的内毒素经稀释后将会出现浓度过低而不被鲎试验法检出的现象。

你知道什么是鲎试验法吗？要想知道这个方法是什么，首先就要了解内毒素是什么。 内毒素是革兰氏阴性细菌等细胞壁中的类脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)成分。看起来这个内毒素好像平平无奇对吧，但其实内毒素对机体是有很大的毒害影响作用的，比如它有热原反应，会使机体出现白细胞增多或者减少的情况，以及骨髓坏死、弥漫性血管内凝血(DIC)等等现象，如果在临床上有脓毒症或者革兰氏阴性菌感染时，严重可致人死亡。 更令人惊讶的是，只需要一点点的内毒素就能让机体产生极其广泛的生物作用和病理作用，所以，在临床上、食品安全、水、饮料等领域进行内毒素的检测是必要的。因为在临床上加强对脓毒症等病理反应进行内毒素检测，可以及时阻止因内毒素引起的症状的出现，从而能对患者迅速采取有效的治疗。而对食品、水、饮料等方面进行内毒素的检测，能更好地保障人们群众的饮食安全及身体健康。  接下来就可以了解什么是鲎试验法了。 鲎试验法（Limulus amoebocyte lysate，LAL）又叫鲎变形细胞溶解物试验，这个试验是目前检测细菌内毒素含量最灵敏的方法了。它比家兔法灵敏10到100倍以上，灵敏度惊人，甚至可以检测出0.01～1ng/ml的微量细菌内毒素，检测结果令人满意。如果用其他的改良方法，鲎试验法甚至可以测试到微微克（Pg/ml）的细菌内毒素含量。而家兔法的检测效率与鲎试验法比起来就实在是太低了，在家兔法中，要想引起灵敏度高的家兔发热，必须要注射1.5ng/kg，如果遇上灵敏度低的家兔还得注射上0.5-10ug/kg。显然，鲎试验法才是人们检测细菌内毒素的理想方法。 鲎试验法的用途是非常广泛的，它能对革兰氏阴性菌感染进行快速的诊断，甚至可以对患者的血液、尿液等进行直接的检测，以此对患者进行最佳的治疗方法。除此之外，鲎试验法还可以对各种药品、注射剂等医疗器械进行检测，以此快速判断它们是否被内毒素污染。最近十几年，越来越多的新方法都用在鲎试验法中，比如同位素标记技术，新频光电技术、免疫电泳技术等方法，让鲎试验法的灵敏度越来越高。 总而言之，就目前来说，鲎试验法依旧是检测细菌内毒素的最佳选择，主要还是因为这个方法的灵敏度高、操作便捷、检测结果快、试剂使用量少，非常适合临床、药品、公共卫生等领域进行大规模检测。今后，如果能很好地解决鲎试剂以及细菌内毒素的操作问题及标化问题，鲎试验法必然会是检测细菌内毒素最理想的方法。

鲎试剂是什么呢？这还要从一种国家二级保护动物“鲎”说起。 鲎生活在海中，是一种形似蟹状的海生节肢动物，而鲎试剂就是从鲎血液中提取的变形细胞溶解物，提取流程比较复杂，需要运用现代的提取技术，再通过低温冷冻干燥制作而成。  因为鲎试剂含有一种特别的酶原，即凝固酶原，所以它主要用于(1,3)-β-D-葡聚糖检测和细菌内毒素检测。由于鲎试验法快速、便捷、高效等特点，所以在鲎试验法中，使用鲎试剂就能非常快速地检测到被检样品的细菌内毒素含量。 鲎试剂的用处是非常多的，它不仅能用在临床应用上，还可以用在制药方面、食品安全、水资源等方面，使用鲎试剂能很快检测出毒素污染，从而保证被检样品的安全。因为使用广泛，而且检测细菌内毒素结果令人满意，鲎试验法还被美国药典、欧洲药典、日本药典、中国药典指定为法定的细菌内毒素检查法。  鲎试剂的研究是从上世纪80年代的时候开始的，但是真正发现鲎血价值的在1956年，到了1965年，才真正制成了不含鲎血的鲎试剂，直到1968年将鲎试剂试验命名为鲎试验法。 鲎试剂的主要成分为鲎血细胞裂解液，主要含B因子、C因子、G因子。在鲎试验中，将鲎试剂与被检样品进行检测，若试管内试剂立即凝固或者变色，就说明该被检样品含有细菌内毒素，该细菌内毒素可致人发热、休克、甚至死亡。所以，鲎试剂在医学上面的研究价值是极大的。 由于我国在鲎试验法领域的研究比较少，而且不同品牌生产的鲎试剂，其质量、灵敏度、稳定性等都有所不同，所以我们和国际上的鲎试剂的差距还是很大的。总而言之，我们要重视鲎试剂的作用，加大研究力度，让我国的鲎试剂药品质量控制方面和鲎试验法领域的拓展方面能占据一席之地，为我国鲎试验法领域的研究提供充实的实践依据和理论依据。

首先我们要知道，浊度法又叫比浊法，是一种用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。那浊度法到底是怎么利用鲎试剂进行内毒素检测的呢？  首先需要将鲎试剂与反应混合物进行配比，通过与细菌内毒素的作用反应后，试管内部会产生坚硬的凝胶，而凝胶则会将液体变得浑浊起来，这时候根据鲎试剂和细菌内毒素的反应可以知道，在内毒素浓度在20~100pg的条件下，试管的浊度程度是和细菌内毒素呈线性关系的。根据这个试验可以知道，浊度法在试验中可以大大减少鲎试剂的使用量，而且整个操作过程是非常快速、高效的，整个试验操作过程也非常便捷，因为仪器的半自动化，试验人员可以非常容易上手。 在这个试验过程中，整个过程必须把握精准度，对鲎试剂的稀释比例一定要了解清楚，样品也要小心翼翼处理，避免进一步污染，然后各取0.1ml加入微孔板中，放入震颤仪中振动60秒钟，这个过程能充分将鲎试剂和样品充分均匀混合。接着在37摄氏度放入环境下静置一小时，然后使用使用光度计在360～380nm处读取试验样品的光密度值。这里还需将稀释过的细菌内毒素的一系列批次进行阳性对照，然后将光密度值和细菌内毒素的含量绘制呈标准曲线，这样就能准确知道试验样品的细菌内毒素含量。 整个操作过程，时间的把控是非常重要的，时间越长，浊度变化越明显，正常情况下，静置一小时即可。假如是在室温的情况下，如果静置长时间的话，试验样品的浊度程度也会有所增强，所以静置结束后，一定要马上读取该试验样品的光密度值，而且还应该每分钟读取一次，重复四次进行，再选取它们的平均值，这样细菌内毒素的含量才能准备，但是要知道这里的变异系数是不能超过1%的。 以上就是浊度法利用鲎试剂进行细菌内毒素检测的方法，大家在检测时一定要把握好细节，试验结果才能更准确。

在贵州瓮安，有一位102岁高龄的抗战退役老兵，他每天都为自己的一份甜蜜事业忙碌着，但也正是这份甜蜜事业让他的生活变得沉重起来。  抗战退役老兵刘崇武的蜂场，坐落在大山深处。这里的每一个蜂箱都整齐摆放，成千上万的蜜蜂忙碌不息。每天一大早，102岁高龄的刘崇武都要拄着拐杖来到蜂场，检查蜂蜜的成熟情况。开箱、取蜂巢、摇蜜、过滤、装瓶，看到今年的蜂蜜丰收，刘崇武却高兴不起来。 在抗战时期，刘崇武老兵五兄弟中，就有三兄弟奔赴抗日前线奋勇杀敌，刘崇武就在其中。毕业于中央陆军兽医学校的刘崇武，于抗战胜利后回到老家当起了农民，后因某些原因，老兵饱受磨难，穷困潦倒，子女因此也受到牵连。 后来，他利用在部队学到的知识，成为了十里八村有名的赤脚兽医，为乡亲们的牲口治病。老兵刘崇武还种植了果树，养蜜蜂等，用勤劳的双手养活一家大小。其中养的蜂蜜，成为了老兵刘崇武的生活来源。  今年老兵刘崇武养的是中蜂（中华蜜蜂），这种蜂适应能力强，善于采集零星蜜源，不需人工喂养，但产量低，每年只能收割一次，品质非常纯正。但是蜂场地处大山深处，信息闭塞，又因疫情原因，已开始收割的蜜蜂却无处可销，而老兵刘崇武拒绝一切社会捐赠的做法，令人肃然起敬。  日子拮据，老兵刘崇武任劳任怨，只为能给大家提供品质天然的蜂蜜。  目前，科德角国际已从老兵刘崇武那里订购了一批蜂蜜，我们将以礼品的形式把这些蜂蜜回馈给我们的合作伙伴，传递爱心和正能量！ 

其实鲎试剂的应用范围算是很广泛的，因为鲎试剂对细菌内毒素会产生特异性的反应，所以它不仅可以用来检查注射液、化学药品的等热原，在实验室的诊断方面还有卫生保健方面都是可以应用的，还有科研领域、临床，特别在检测脑膜炎上，是非常准确有效的。  一、在临床上的应用 采用鲎试剂进行的鲎试验法在早期就能对有发热症状的内毒素血症患者的症状进行预测，从而达到早期干预的效果，进行快速治愈。大量的实验数据证明了，患者之所以患有革兰氏阴性细菌败血症的很多症状都是因为内毒素血症的原因。但是常规检测内毒素血症的的诊断手段，往往需要好几天的时间，所以，有研究人员就开发了能在临床上快速检测内毒素含量的方法。 除此之外，采用鲎试剂的鲎试验法还能对心脏手术进行循环内毒素的检测。患者在做完心脏手术后可能会出现发热症状，医护人员用鲎试剂就能快速诊断出发热的原因，这样就能对进行透析的腹膜炎患者是否感染革兰氏阴性菌进行对症下药。 简单介绍这两种在临床上的应用，相信大家都对鲎试剂有了解了。其实鲎试剂还能用在消化科、透析科、肿瘤科等等，作用是非常大的。 二、其他的热原检查 鲎试剂的用处其实是非常多的，它不仅仅可以用在临床的诊断上，还能用在监测水环境中，通过检测水中的内毒素含量，来确定水是否安全，又是否被污染，来保障人民的用水健康。 其次，鲎试剂还能用在食品的检测上，厂家生产食品到出现在市面，其实会经历漫长的流程，其中一个关卡，就是要对食品进行细菌内毒素检测，检测细菌内毒素的含量是否超出限值范围，一旦超出细菌内毒素的限值范围，食品就会出现食品安全问题，从而不能上市。 对于那种久放的食品，其实也需要进行细菌内毒素检测，因为储藏久了的食物就容易出现保管不当从而滋生细菌，这时候要是重新拿出来，就需要用鲎试剂对食品的内毒素进行快速检测，这样才能保证食品安全。  其实鲎试剂的应用真的非常广泛，而且采用鲎试剂进行细菌内毒素的鲎试验法是非常经济的，而且检测速度又快、准确、便捷又灵敏。希望鲎试验法能在方方面面使用越来越广泛，有效解决各种问题。

内毒素是药品污染热原的主要原因，在GMP条件下生产药品的热原控制，无内毒素即无热原[1]，这是药典普遍采用《细菌内毒素检查法》代替《热原检查法》的依据。但是，某些药品特别是血制品，由于其生产工艺中，一般需经过纤维素膜过滤，使污染Glucan样物质的机会增加。 藤原博等[2]以普通鲎试剂和特异鲎试剂检测商品血制剂（白蛋白、球蛋白）内毒素含量，并与热原检查结果比较。实验表明，使用普通鲎试剂阳性检出率高于特异鲎试剂，而后者的阳性检出率与热原检查相符。同时作者向血制剂中添加内毒素后，再用两种鲎试剂测定内毒素的含量，结果普通鲎试剂检出量远高于添加量，而特异鲎试剂检出量与添加量基本一致。  作者还以两种鲎试剂检测了精制吸附百白破三联菌苗，并与家兔升温曲线比较，结果无大差别，说明精制吸附百白破三联菌苗不像血制品含β-Glucan样物质，认为血制品的内毒素检测，使用特异鲎试剂可以与家兔热原检测得到十分一致的结果。 lkemura K[3]等以普通和特异鲎试剂显色基质法，定量测定经静脉注射免疫球蛋白治疗患者的血浆和尿中内毒素，血浆中鲎试验反应物的含量随给患者的免疫球蛋白量成比例增加，多次使用该反应物在血中累积，从尿中排出的量不足5%。该反应物很可能来自生产血制剂时使用了纤维素膜。作者认为，对接受免疫球蛋白患者进行血中内毒素测定时，对测定结果的解释应给予特殊考虑。 池屯胜美等[4]对肾功能不全进行血透析患者的血中内毒素定量测定，使用普通鲎试剂显色基质法经常出现阳性结果，但病人并未出现发热和白细胞增加，经过对人工透析膜进行检查，证明用铜铵人造丝膜有鲎试验反应物游离，而用特异鲎试剂显色基质法时，阳性检出率很低，说明这些鲎试验反应物不是内毒素，而是可以活化G因子的物质。 参考文献：[1] Noordw ijk J V an, et al European workshop on detection and quantification of pyrogen Phameuropa Special Issue,1989,1 (1): 1[2] 藤原博等.M easurem ent of endotox in in blood products using an endotoxin-specific lmulus test reagent and its relation to pyrogen activites in rabbit药学杂志(日),1990, 110 (5): 332[3] kamura K, ct al False- positive result in limulus test caused by limulus amebocy telysate- reactive material in immunog lobulin products J Clin M icrob,1989,27(9): 1965[4] lkcmura K, et al透析膜に由来するリムルステト阳性化物质について. Jpn J Clin Pathol, 1986,34 (3): 313

自从1981年日本学者Kakinuma A 等报道“一种抗癌物质( 1-3) -β-D-葡聚糖[(1-3)-β-D-Glucan可使鲎试剂凝聚”以来，由于其涉及细菌内毒素检查的特异性，引起各国学者的注意。  一、（1-3）-β-D-葡聚糖的本质与来源 Kakinuma A等在作抗癌物质葡聚糖热原试验时，不含发热物质的葡聚糖能引起鲎试验呈阳性反应。Loretta A和Pearsen FC也报道，血液透析器上存在鲎试验反应物质（LAL-Reactive Materia l，LAL-RM），以后有报道凡经过铜铵人造丝透析膜的制品，均存在使鲎试验阳性，但不是内毒素的物质。1983年日本学者中村隆范报道了这一物质具有如下结构: 除（1-3）-β-葡聚糖外，（1-4）、（1-6）-β-葡聚糖同样使鲎试验产生阳性结果，这些物质的总称为真菌多糖（Fungal polysaccharide），普遍存在于真菌细胞壁。如果这类物质具有像内毒素一样的致热活性，细菌内毒素检查和热原检查结果的符合率会接近一致。但是恰恰相反，真菌多糖似乎不是一种致热物质，文献报道1.0、0.01、0. 0001mg/mL的真菌多糖溶液，剂量按10mL/kg，进行热原试验的结果，3h内3只家兔最高升温的均值分别为0.23±0.03，0.13±0. 09，0.20±0.10。这将导致在使用普通鲎试剂检测某些样品时，出现细菌内毒素检查不合格，热原检查合格的现象。造成对这些物质热原检查的错判。1990年Ikemura K等将鲎试验反应机理和各种干扰内毒素检查物质及干扰部位归纳如下:  由此可知，鲎试剂检测内毒素出现非特异性结果是不奇怪的。为了使细菌内毒素检查与热原检查的结果趋向一致，使用特异鲎试剂是完全必要的。 二、特异鲎试剂制备 1968年Levin J和Bang F B创建鲎试剂以来，使内毒素的检测成为灵敏、快速、简便的方法，已被举世公认，并被美、日、中、欧洲药典以《细菌内毒素试验》收载，但是由于上述非特异性的存在，使这一试验的实际应用受到一定限制。为了克服这一弊端，各国学者进行了深入研究。由于上述鲎试验反应机理已被阐明，设法阻止右侧旁路反应，便能使鲎试剂对内毒素的检测达到特异性的目的。 日本最先推出的特异鲎试剂其商品名为En-dospecy其生产工艺的特点是将普通鲎试剂中存在的G因子，以亲和层析方法分离去除。国内有人称无（弃；去）G因子鲎试剂。显然，鲎试剂中没有G因子，即使被测样品中存在真菌多糖（非内毒素），也不能产生活化的G因子，在反应旁路系统中就不能激活凝固酶原，旁路反应被阻断，使成为对内毒素具有特异性。 国内吴伟洪等报道，以同样方法制备了仅含C、B因子的鲎试剂。但是以这种工艺制备的特异鲎试剂，由于在分离G因子的过程中，必需防止带入微量内毒素，即所用分离试剂、柱床、器皿及操作过程，严防内毒素污染，不仅增加了制备工艺的难度，也必然增加鲎试剂的成本，因此很难推广应用。 1989年Berzofsty R N报道，在制备普通鲎试剂时，为了提高检测内毒素的灵敏度，均采用氯仿提取存在于鲎试剂粗制品中的抗LPS（脂多糖）因子。氯仿提取的结果确实增加了鲎试剂的灵敏度，但同时将存在于鲎试剂粗制品中的抗G因子一同除去，这就使普通鲎试剂易被真菌多糖激活，增加了普通鲎试剂的非特异性。因此提出不用氯仿提取，改用一种特殊（专利）试剂，只除去抗LPS因子，而保留抗G因子，以达到即增加了对内毒素的敏感性，又削弱了真菌多糖活性G因子的能力。这是从鲎试剂的生产工艺上进行改革，实现提供商品特异鲎试剂的一种方法。 1990年 Tsuchiya M报道，由于真菌多糖与普通鲎试剂反应形成凝胶，有一个特定浓度范围（10 -3~10-6mg/mL），大于或小于这个浓度都不能成胶，故在制备普通鲎试剂的基础上，加入过量的真菌多糖( 1mg/mL)，可阻止G因子的活化，即“封闭”了旁路，达到制备特异鲎试剂的目的。显然采用这一措施制备特异鲎试剂，较以上两种方法既简便又经济，可使特异鲎试剂商品化。

热原系指一切可以引起人体及动物发热反应的物质。细菌内毒素是一种与革兰阴性菌细胞壁相关的热原物质，是至今发现在水溶液中普遍的热原。药品注射剂中的热原检查是药品安全性的重要检验项目之一，自1942年美国首先将家兔法作为药品的热原检查之后，这项检查对保障药品的安全性方面发挥了重要作用。随着制药工业迅速发展、新药品种的不断增加，家兔法的的局限性日益突出（如放射性药品、抗肿瘤药物等药物本身药理作用干扰家兔升温试验）。20世纪60年代创建了微量细菌内毒素的鲎血细胞溶解物检测法（简称鲎试验法），并应用于药品和生物制品的热原检测。下面就细菌内毒素检查法国内外发展简况进行阐述。  1、国外发展简况 1968年 Liven J.和 Bang F.建立了鲎试验法。1973年美国FDA制定了鲎试验准则，阐明“鲎试剂是一种检测细菌内毒素的灵敏指示剂"。1980年美国FDA发布用鲎试剂检查人用和兽用注射剂成品内毒素的准则。同年美国药典20版收载了细菌内毒素检查法，但在药典各正文中未涉及。1984年美国药典增补本中，修订了该检查法并规定了40种放射性药品和5种注射用水用细菌内毒素检查法替代热原检查。美国药典22版第五增补本规定185种药品以细菌内毒素检查取代热原检查。美国药典23版1至7增补本采用细菌内毒素检查法的品种已达 620余种，保留热原检查的品种仅约30种，同时除了经典的凝胶外，还收载了动态浊度法、动态显色法、终点显色法。 欧洲药典于1987年、英国药典1989年增补本分别收载了细菌内毒素检查法。1990年日本药局方增补本也收载了这一方法。英国药典1993年版及增补本（1994~1997）规定细菌内毒素检查法的品种有40多种。 2、国内发展简况 在我国，1975~1982年是鲎试剂的研究阶段。1988年卫生部颁布细菌内毒素检查法，允许4种药品使用细菌内毒素法初试[1]。1993年中国药典1990年版第2增补本收载细菌内毒素检查法，但在药典各正文中涉及[2]。1995年 Chp95二部附录规定注射用水等5种药品用细菌内毒素检查法取代热原检查。2000年 Chp2000二部规定细菌内毒素检查法的品种有47种[3]，并且增加了细菌内毒素检查法应用指导原则。2005年Chp2005二部规定细菌内毒素检查法的品种有120种[4]，同时检查法中增加了定量测定法中的浊度法和显色基质法。 参考文献:1.中华人民共和国卫生部标准[S]WS1-228(Y-47) -88.2.ChP(中国药典)[M].1990.第二增补本,57.3.ChP(中国药典)[M]. 2000.Vol (二部):前言.4.ChP(中国药典)LM].2005 . Vol l(二部):前言.

自1988年10月卫生部部颁标准规定[1]，应用鲎试验法在5种大输液中检查细菌内毒素取代热原检查法。由于鲎试验法具有灵敏度高，特异性强及简便快速等优点。本文采用国产鲎试剂对100批大输液进行热原测定，并与家兔法对照，结果证明鲎试验法（灵敏度为0.5EU/ml）检查阳性率较家兔法高，我们通过降低鲎试剂的灵敏度，使假阳性结果出现率降低。 一、实验方法和结果 部颁标准细菌内毒素检查仅规定5种注射剂的内毒素限值（），根据5种注射剂的细菌内毒素限量计算，热原检查家兔法剂量为10ml/ kg（M）和我国内毒素标准品的致热阈10EU/kg（K），计算出5种大输液理论限值（L），根据药品内毒素限值：L=K/M[2]= 1EU/ml，依据计算结果与规定，大输液的内毒素限值为≤1EU/ml。笔者通过对100批大输液鲎试验法检查出现的10批阳性结果进行试验性研究，其中1管为阳性者3批、2管为阳性者7批的品种进行降低鲎试剂灵敏度后和家兔法同时复试，结果见表1。  从上表结果可见，灵敏度为0.5EU/ml的鲎试剂在细菌内毒素检查中，结果为1阳、1阴时，再用家兔法和灵敏度为1EU/ml鲎试剂重复试验，家兔体温无变化，鲎试验法为阴性结果，此类结果无需4管复测，即认为是符合规定。对2管阳性或在复测中3管、4管为阳性者，需用适当灵敏度鲎试验法复测，我们对5批合格的大输液加入内毒素，进行适当灵敏度鲎试验法与家兔法检查，灵敏度为1EU/ml鲎试验法的内毒素检查与家兔法的热原检查，结果两者相符。 二、讨论 1.鲎试验法具有快速、准确、经济和操作简便等优点，因此用适当灵敏度的鲎试剂检查法代替家兔法对大输液进行热原检查复测是可行的。 2.部颁标准规定，将试管从水浴中轻轻取出，缓倒180°时，管内凝胶保持完整、不变形、不从管壁滑脱者为阳性，否则即为阴性，笔者通过实验结果证明，若1管阴1管阳，不需要重复试验，笔者认为可判定为合格。 3.对2管或3管、4管阳性者，用灵敏度为1EU/ml的鲎试剂代替家兔法进行热原重复试验。笔者认为是可行的。 以上实验结果和讨论仅供参考。 参考文献：[1]wS1-（B-122）-91卫生部标准[2]夏振民.药品细菌内毒素检查的限值.药物分析杂志，1995；15（3）：54

输液是临床上最常使用的一种治疗措施，有着十分重要的地位及作用。但热原反应时有发生，尤其是在气温较高季节多见，给病人带来痛苦，个别甚至造成生命危险。所以，预防热原反应的发生就显得极其重要，一起来看看临床输液预防热原的反应措施吧！  1.在生产过程中要严格执行操作规程： ①回收输液瓶要严格检查，剔除破损瓶子，无铝帽盖者要另行处理，并要剔除已长霉菌的瓶子以及有回血的瓶子。 ②涤纶膜衬垫必须均匀，不使漏气，铝帽盖轧口必须紧密。 ③严格把好灯检关，不使漏检，在急诊室配发窗口应安装日光检查灯，在临用发出前再作澄明度检查，以保证质量。 2.临床护士在输液前必须做到： ①在日光灯下对输液要进行详细检查，例如瓶子有无破裂，铝帽盖轧口有无松动，输液澄明度是否好、有无异物、有无菌落生长等。 ②在橡皮塞摇入针头时，不要直摇，以防胶塞碎屑混入输液，应该由45°角度斜刺入胶塞。 ③不要随便外加其他药品，以防引起配伍禁忌及澄明度不合格。 ④在输液操作时应将最初30～50ml输液经过胶管后弃去。 3.在应用塑料袋装输液时必须注意： ①轻拿塑料袋，并稍加压力详细检查有无漏气情况，特别要注意塑料袋与导管联接处有无微小破裂、渗漏。 ②塑料袋输液在添加药品时必须注意混匀。据国外报道，由于从塑料袋上部添加10%氯-化-钾以致沉积于下部而“分层"，于是下部浓度特别高，发生过引起高血钾症导致死亡的病-例。该作者试验用蓝色染料加入于氯-化-钾液中观察到这种现象而证实。因此将挂在输液架上待输的溶液，临时添加药液，企图以挤压的办法来达到混匀是不可能的。必须拿在手中反复上下倒转，才能充分混匀。

输液在临床应用日趋增多，一般手术禁食患者每日均需输注葡萄糖液等2000~3000ml，其他如腹泻、烧伤、休克、高热患者的用量也较大。据历年报道，每到春秋季节，室温较高，常有散发性、个别病人发生输液热原反应，甚至将长有霉菌菌落的输液注入患者，非常危险。输液是在严格条件下配制，并经质量鉴定、无菌、热原等试验合格后才由药房供应临床。但为什么会经常发生热原反应呢？  1.属于生产过程中留下的隐患 ①输液瓶等包装材料微细裂纹：由于输液生产工艺及贮存运输流程较长，包装材料大多是玻璃瓶及塑料袋，产品虽经灭菌消毒，但个别瓶子在清洗、搬运过程中常可碰撞而引起微细破裂，不易为人们觉察。有些裂纹似蚌壳形，有些细圆点，有的似条纹，需在检查灯下，从不同角度旋转输液瓶才可看清。此类输液在存放过程中，一旦空气从裂纹中进入则易被污染。值得注意的是有些裂纹被标签掩盖，更难发现，此外有些裂纹是在瓶口处，往往被封口铝帽盖所掩蔽，更不易发现，因此使用前需详加检查。塑料袋制品在熔封处要特别注意，检查时可用手稍加压力，看是否有漏气等情况。 ②涤纶衬膜及橡皮塞漏缝：由于目前橡皮塞质量较差，容易污染药液，所以输液用胶塞沟需用涤纶膜衬填以提高输液澄明度质量。 生产时由于分装速度过快或疏忽，在衬填涤膜时没有撰正而是歪斜的，或胶塞按下时不正而形成涤纶蕨褶折不平，于是不能均匀地包在橡皮塞上，以致漏气。 ③铝帽盖封口松动：由于封口机经常使用机械零件容易松动，有时封口不严密而导裂瓶口漏气。 ④个别输液瓶清洗不洁：输液瓶清洗工作量较大，有机械清洗或手工清洗，必须保证每一个瓶子均清洗洁净，符合要求。 ⑤严防个别产品遗漏消毒：在成批生产中要严防个别产品遗漏消毒而混入成品中，有的单位曾发生过输液瓶少数遗漏而未经消毒，以致发霉变质。 2.属于装卸贮存过程中造成的问题。 ①输液在贮存过程中，因成品堆压而造成封口松动，有的贮存箱较低矮，而输液瓶超过箱子高度，直接整箱压在铝帽盖上，可使胶塞铝盖松动。 ②在装卸运输过程中，不注意轻拿轻放，使瓶子受损，造成微细破裂。 3.属于输液器、输液导管等方面的问题 输液均需通过输液导管而输入体内，输液器装置目前有二种： ①间接输液。其装置有玻璃吊瓶及输液导管，包括胶管、莫斐氏滴管、玻璃接管、针头、塑料细管。据报道本法如操作不严，也可造成污染，如开始未弃去少量液体，或将输液瓶口放在吊筒口上倾到液体，或吊筒口开启时间较长，均易造成输液中异物混入。例如某单位有一吊筒内的输液快要输完时，发现液面上有一扑娥。另有一个吊筒内发现一只蚂蚁。 ②直接输液。其装置是原输液瓶直接装在输液导管上。 由于输液装置及输液导管处理不符合要求，染有热原而引起反应的情况亦是常有的。据报道某医院在病人发生输液反应时，立即对库存的同批号输液作了复查，均未检出热原，而检验通过输液导管的样品则有16批热原阳性，后经该院检查此批输液管热原阳性的原因，是由于高压消毒锅 由此可以看出，输液导管亦是热原污染的主要途径，导管一经使用，如未及时冲洗，便粘附有输液（或血液），成为微生物良好的营养剂，如果温度适宜，很易迅速繁殖，导管虽经高压消毒，但不能破坏热原，所以洗涤处理稍不严格就可引起反应。因此必须严格按操作规程处理，必要时可作热原检查。

凝胶法实验过程时间短，消耗样品量少，且具有使用设备简单，费用低等优点，作为《中国药典》“仲裁"检查方法，广泛用于注射剂药品细菌内毒素检查。  1.干扰试验的必要性 鲎试剂凝集反应是一种二价阳离子酶反应体系，有许多干扰反应的物质会干扰凝胶的形成。在新样品测定中，必须首先进行细菌内毒素干扰试验，确定是否存在干扰样品出现缩合反应的因素。为了保证所选处理方案能够在不灭活内毒素情况下有效消除干扰，采用预先添加的标准内毒素再处理液进行干扰试验。 2.可能会出现的异常结果及其原因和解决方法 2.1造成呈假阴性的可能原因及解决方法 原因可能是：①内毒素工作标准中存在的一些问题，如滴度标注不准确，过期或贮存不当导致失效，稀释误差或稀释振荡不够，对照管没有达到2λ阳性内毒素浓度；②问题出在鲎试剂。例如，过期失效，振荡不当，灵敏度标注不准确，会产生气泡，鲎试剂酶蛋白变性，鲎试剂破坏；③温控器温度不符合要求或保温时间不够。 解决办法包括：规范内毒素标准效价的审查和鲎试剂在保质期正确储存和使用的敏感性；内毒素稀释应准确，确保PC管添加2λ内毒素；当使用可溶解的鲎试剂时，沿着管壁慢慢加水，让混合器振荡30s。避免剧烈振动产生气泡，确保恒温器温度和保温时间正确。 2.2造成假阳性的可能原因及解决方法 原因可能包括：实验设备受到污染，经热原、外源性内毒素或微生物污染不能完全灭活；试验中由于误操作造成的内毒素污染；BET水不符合要求，内毒素超标，培养温度不正确等。解决方案包括：按照2015年版《中国药典》的规定对实验仪器进行处理；选择合格的BET水，确保正确的培养温度、时间和操作。 总而言之，细菌内毒素检查法已被列入许多国家药典。方法学研究表明，用细菌内毒素法取代家兔热原法的药物种类较多，因为它比家兔热原法更精准、快速、简捷、经济、容易推广等诸多优点。